连续生物工艺中你不知道的“黑”科技

随着生物制药行业的飞速发展，药企将会布局越来越多的项目管线以及开发多样化的药物分子。近些年，药品审评审批制度的改进，使得大批生物药进入临床的步伐大大加快，从而惠及更多的患者。2018年12月君实拓益以其K/O药20-50%的价格，轰动业内，预计一年可以为患者节约十几万元。然而，对于生物制药企业而言，机遇与挑战并存，生物类似药的竞争将会愈演愈烈，一方面，如何有效降低成本，造福更多的患者；另一方面，如何提高产品质量，赢得更多的市场份额，已成为生物药企的生存法则。

为了有效地降低生产成本，提高厂房利用率，需要新技术的变革。越来越多的生物制药巨头已转向连续生物生产工艺。2016年4月，美国强生公司位于波多黎各的药品生产基地的连续制造生产车间工艺转换获得FDA批准，这是FDA第一次批准批制造向连续制造的生产工艺变更，目前有三个抗体品种已部分使用连续制造工艺。礼来制药将爱尔兰作为全球连续制造中心；葛兰素史克在新加坡建立连续制造工厂，并于2016年投入使用；安进在新加坡建立单克隆抗体的连续纯化制造车间；最近，BiosanaPharma宣布其开发的奥马珠单抗生物类似要获批进入临床实验，是目前第一个使用全连续生产工艺开发的单克隆抗体药物。

与此同时，包括FDA,EMA, PMDA在内的法规监管部门开始更多关注连续制造工艺并鼓励制药企业用更有效的制药工艺来生产更安全、更稳定、更经济的药物。早在2017年，FDA就发布了连续制造（Continuous manufacturing）的意见征求稿;2019年2月26日，FDA颁布了连续制造的指南草案，对于连续制造的法规指导做了进一步说明。

连续生产工艺

生物制药目前都是以Batch生产（批生产）方式，即从工艺起点开始，经过多个有停顿的中间步骤，最终获得终产品的过程。连续生产工艺即连续生产，在食品， 石化和化学品生产上已经被使用多年，和Batch不同的是，连续生产中原料在工艺起点持续加入，终产品在终点持续收获，理论上中间没有停留的步骤，所以被称之为连续生产。在这一过程中，药品的质量在生产过程中可以被很好的控制，而不是只依靠终产品达标来放行。

连续生产工艺的优势

1. 降低工艺风险，提高药品质量

由于批生产过程中会有不同工艺步骤的停止和启动，在每一步中都会带来一定程度的复杂性和不确定性。而连续生产工艺有助于产品的始终如一。与此同时，连续生产工艺适用QbD的工艺设计原则，从而提高工艺灵活性。

2. 减少独立操作单元的周转及多批次间隔时间

连续生产工艺通过模块化的操作集成，减少不同独立工艺单元的暂停和停止时间，产品质控放行时间，以及更小的设备和占地空间需求，从而降低生产成本, 有报道连续生产工艺可以降低75%的生产成本。

3. 减少厂房空间及厂房建设时间

连续生物工艺不需要很大的硬件配置即可满足产能需求。相比目前平均5年时间的厂房建设时间，未来的厂房建设时间仅需要18个月，大大缩短了产品上市时间，从而提升企业竞争力。

连续生物工艺中的“黑”科技

上游工艺

连续灌流培养

灌流培养技术通过向反应器内连续补加新鲜培养基，同时取出耗竭的培养基，可维持更长的细胞培养时间，可高达数月。相比目前主流的批次流加培养，灌流培养技术通过延长培养时间，获得更高的细胞密度，增加目的产物表达量，与此同时，目的产物在生物反应器中更短的滞留时间，使得产物维持更好的质量。灌流培养技术使用的生物反应器的体积更小，节约硬件成本的同时，可在较小的生产空间内实现同等或更高的产量。

除了灌流培养的生物反应器，用于灌流培养的培养基也备受关注。如何高效利用培养基，在很大程度上降低成本。这是由于相比批次流加培养，灌流培养工艺中培养基的消耗量至少三倍以上。通常通过高密度少培养基同时减少灌流体积的培养方式来提高灌流培养工艺的经济性，然而普通的培养基很难能够维持这样的细胞生长稳态。适用于灌流培养工艺的培养基不仅需要养料充分，而且要最大程度减少毒副产物的产生。EX-CELL® HD灌流培养基，可有效提高产能并使细胞灌流率从80 pL/c/d降低至40甚至20 pL/c/d （图1）。

图1. EXCELL® HD 灌流培养基prototype细胞灌流率数据比较

下游工艺

高密度细胞培养液澄清

为了有效提高灌流培养的经济性，在减少培养基用量的同时，需要高细胞密度培养以达到预期的滴度，然而，高细胞密度培养液由于细胞碎片及释放的HCP和DNA大大增加，从而对于传统的下游澄清和纯化带来了越来越大的负担。如何有效地提高高密度细胞培养液澄清步骤载量，去除HCP和DNA杂质，将在很大程度上降低企业的生产成本。Millistak+®HC Pro由于其全人工合成材质的特点，更加纯净，冲洗体积可有效减少50%，独特的材质，使得载量大幅提升的同时拥有较好的HCP 和DNA去除效果(图2)。

图2. Millistak+® HC Pro （D0SP/X0SP）载量与杂质去除能力对比

对于更高密度的细胞培养，如大于15x10^6 c/mL的培养液澄清，则特别适合采用絮凝技术。絮凝技术是通过降低料液的pH值，或者添加离子型的絮凝剂，通过静电作用吸附细胞碎片，HCP以及DNA聚集为更大的颗粒分子，进一步通过具有密度梯度结构的Clarisolve®深层过滤器实现一步澄清。聚合物改性的聚烯丙胺（mPAA）和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pDADMAC ) ，是非常有效的絮凝剂，配合Clarisolve®深层过滤器结合使用时，对于高细胞密度料液的澄清有很好的效果（图3）。目前，已有上市药物采用絮凝技术提高工艺效率与经济性。

图3. 采用mPAA进行絮凝处理前后的澄清过滤载量对比

流穿精纯平台

关于下游工艺的整合，目前有很多的策略。例如，通过串联亲和层析和阴离子交换层析，实现半连续的工艺连接；应用多柱位连续层析系统，通过有效提高层析填料的载量和工艺流速，来提高生产效率。或是将两步流穿精纯工艺进行整合，如阴离子和阳离子层析步骤，仅通过泵就可以实现两步精纯工艺。有研究指出，相比传统的精纯层析工艺，通过流穿精纯平台，可以简化层析工艺，缩短工艺时间，减少填料使用量，由于不需要使用tank而减少硬件设备的投入，从而有效提高产能，降低工艺成本。若要实现阴阳离子层析的流穿精纯工艺，采用传统的吸附模式阳离子层析不易实现。而采用新型的Eshmuno® CP‑FT阳离子层析填料，通过流穿模式实现多聚体的去除，相比传统的结合洗脱模式，载量提升10倍。CP‑FT的神奇之处在于其独特的触手型化学修饰，通关前沿层析的原理，实现聚集体置换单体从而有效去除聚集体的目的（图4）。以1 kg抗体纯化为例，采用传统的吸附/洗脱模式的阳离子层析，按照80 g/L的载量，需要使用12.5 L 的填料以及313 L 的缓冲液；而采用CP-FT，载量为1000g/L, 仅需要1 L的填料和15 L的缓冲液(图5)，通过减少缓冲液和填料使用量，来有效降低成本。采用流穿精纯平台，载量显著提高的情况下，仍然有很好的杂质去除效果（表1）。

图4.CP-FT的单体收率及多聚体去除

图5.传统吸附/洗脱阳离子及CP-FT用量对比

表1. 传统吸附/洗脱阳离子及CP-FT纯化效果对比

膜层析

目前，连续多步层析已应用于连续生物工艺的纯化操作单元。与此同时，新的层析技术也在不断地发展，例如一次性膜层析技术，可以大大提高产能及杂质去除。由于一次性使用的特点，省去了验证，清洁，存储的相关工艺时间，节约人力和工艺时间成本。Natrix™膜层析技术，采用独特的3D大孔结构，大大提升了膜孔内的表面积，从而结合高密度的官能团有效提升载量；连通的孔隙结构，有效提高通量(图6)。以生产1000g抗体为例，采用传统的层析工艺，除层析柱外，需要6.3 L 层析填料，且工艺时间需要6小时。而采用Natrix™ HD-Q,采用0.115 L MV在2小时内即可完成生产(图7)。

图6. Natrix™结构与传统层析填料及膜层析结构对比

图7. 膜层析工艺的经济性分析

在线病毒灭活

从传统的批次低pH灭活工艺转向在线持续的病毒灭活工艺，通过连接的管道式灭活箱来取代传统的tank（图8）。在线病毒灭活，将有效减少占地空间，不再需要多个tank存储protein A亲和层析洗脱液，与此同时，在管道灭活腔中的停留时间会比传统tank中孵育时间更短，使目标物质在酸性条件下孵育更短的时间，从而减少目标蛋白的降解，提高产品质量。研究发现，采用在线病毒灭活的效果同传统的批次低pH灭活工艺（图9）。

图8. 管道式灭活箱

图9. 不同pH条件下在线病毒灭活与传统病毒灭活效果比较

单向切向流 （SPTFF）

单向切向流在其他行业应用广泛，但在生物制药行业中刚刚兴起。通过单向切向流技术对样品进行浓缩，不需要对样品回流进行循环，减少对样品剪切力损伤的同时，不需要使用tank,从而减少设备占地空间。Genetech曾通过单向切向流技术解决了目前厂房无法满足大规模生产的需求。另一方面，通过单向切向流进行样品在线浓缩，减少下一步纯化工艺的上样体积，有效节约上样时间，工艺时间大大缩短，从而使得产能提高5倍。与此同时，根据吸附层析的平衡等温线性质，高浓度的杂质会更容易吸附在层析填料上，从而使流穿阳离子的载量更高。单向切向流还特别适合于洗脱后样品的脱盐和浓缩处理，省去换液及样品稀释的工艺步骤，有效提高工艺效率。研究发现，采用2000 L批次培养与200 L灌流培养，整合SPTFF与Eshmuno® Q的工艺成本，相比传统的纯化工艺成本而言，可降低30-40%（图10）。

图10 整合SPTFF的连续工艺与传统工艺的经济性分析

A. 2000 L批次生物反应器 B. 200 L灌流培养生物反应器

连续生物工艺面临的挑战

连续的生物工艺由于其各个工艺步骤都是连续的，对于工艺中的在线监测和在线质量控制是一大挑战。与此同时，连续工艺的复杂性，如何使用QbD来开发连续工艺，连续工艺的工艺转移及放大，以及整个连续工艺中的污染风险控制，都是需要继续深入探讨的话题。

新技术发展为平台技术往往需要时间的验证和更新，连续生物工艺由于其显著降低成本的优势而备受关注，近两三年会更多侧重邻近工艺的整合，预计在2025年会实现全面的生物连续工艺。在新技术不断涌现的时代，诸如灌流培养基，高密度细胞澄清方案，流穿式阳离子层析，在线病毒灭活以及单向切向流的应用，将大大提升产能并有效降低生产成本。