Automation of three ELISA protocols on the Opentrons OT-2 with an ondeck Heater-Shaker Module

酶免疫测定（EIAs）或酶联免疫吸附测定（ELISAs）是指通过高度特异的抗体抗原相互作用来检测和量化液体样本中的目标分子（例如抗原）的技术。这种测定通常设计在96孔或384孔聚苯乙烯板中进行，这些板为抗原的固定提供了固体表面。抗原可以通过直接将抗原附着在固体表面或通过使用预先涂布在固体表面的捕获抗体来实现。通过这一过程，有助于将抗原与样本中其他非目标分子分离。

夹心EIA（或ELISA）是最常用的测定格式。该过程通常包括以下步骤：1. 将捕获抗体（即针对目标抗原的特异性抗体）通过被动吸附的方式附着到板子上（例如，8孔或12孔条组装在适合96孔微孔板读取器的框架上），如果板子没有由供应商预先涂布该抗体；2. 将待分析的样本添加到抗体涂布的板子上，使目标抗原被捕获；3. 将酶（例如辣根过氧化物酶或HRP）标记的检测抗体暴露于固定的目标抗原上；4. 加入酶的底物以产生可测量和量化的信号。人类纤维蛋白（FN）EIA试剂盒（Takara Bio，美国圣何塞，加利福尼亚州，美国）是一种用于定量测定血清、尿液、细胞培养上清和其他生物液体中可溶性人FN的体外分析试剂盒。该试剂盒提供足够用于EIA方案设计和验证的试剂和材料。FN在细胞表面、细胞外基质和血浆中广泛分布，参与细胞与基质的粘附、细胞迁移、细胞形态调节和其他细胞功能。 Takara的FN EIA试剂盒利用两种鼠单克隆抗-人FN抗体形成抗体-抗原-抗体的夹心结构：捕获抗体预涂在8孔条上，检测抗体与辣根过氧化物酶共轭。通过将这种复合物暴露于辣根过氧化物酶的底物中，可以发展出光度信号，吸光度与样品中目标（即人FN）的存在量成比例。

竞争性ELISAs通过检测信号干扰来测量抗原的浓度。简单来说，目标抗原与预先涂布在板上的参考抗原竞争酶共轭抗体的结合。样品中目标抗原存在的越多，参考抗原与抗体结合的能力越弱，产生的信号越弱。在某些竞争性ELISA试剂盒中，例如本研究中测试的Tecan的Cortisol Saliva ELISA（瑞士Männedorf），酶由参考抗原携带，与目标抗原竞争抗原抗体相互作用。另一种在OT-2上验证的ELISA是SARS-CoV-2 Surrogate Virus Neutralization Test kit（Cell Sciences，美国马萨诸塞州新伯尔伯港市），用于测量SARS-CoV-2感染后或在疫苗接种后产生的循环中和抗体。中和抗体通过阻断血管紧张素转换酶2（ACE2）和受体结合域（RBD）的结合来抑制SARS-CoV-2进入细胞。该试剂盒提供预涂布的病毒刺突蛋白RBD的板，并利用竞争性ELISA的格式，通过引入HRP共轭的ACE2与中和抗体竞争捕获RBD。

尽管测定设计多种多样，但ELISAs通常遵循类似的流程。完成测定所需的试剂转移、孵育和重复洗涤等一般步骤可以很容易地在OT-2上进行自动化。在此过程中，要进行连续的洗涤以去除测定步骤之间未结合的分子。为了防止剩余的溶液被带到下一个测定步骤中，必须将多余的液体完全吸走。Opentrons 8-Channel Pipettes可以执行精确和准确的液体处理，以满足ELISAs中试剂转移和洗涤的需求。此外，该测定可以通过集成在OT-2平台上的Opentrons温度模块或加热摇动模块进行完全自动化，以提供设定的温度进行样品孵育，例如在37°C下促进抗原抗体相互作用。