Automated NGS Quantification, Normalization and Pooling Using the OT-2

准确且可重复的DNA定量是获得一致的NGS测序结果所必需的。测量DNA的总数量和片段大小的分布对于在Illumina®流细胞上获得最佳的集群密度非常重要。这两个因素都会影响数据质量和总测序输出。在常见的DNA定量方法中，qPCR具有最高的灵敏度。与荧光或分光光度法不同，qPCR能够通过与Illumina p5和p7序列结合的引物选择性定量形成集群的完整长库片段。

然而，qPCR的设置需要大量时间，其结果对微小的移液差异非常敏感。自动化NGS定量为获得可重复、高精度的结果提供了一种简化的方法，同时最大限度地减少了手工操作时间。Opentrons OT-2自动化液体处理平台能够进行高精度的移液操作，并且可以根据需要进行定制，以自动化各种NGS工作流程。在这里，我们展示了OT-2在自动化NGS定量和标准化方面的能力，为Illumina测序做准备。

为了评估NGS工作流程中的两种qPCR标准化方法，进行了两项研究。标准方法，每个样本独立处理；酶法，样本混合并用NormalaseTM处理。Normalase酶法标准化取代了基于磁珠的净化，同时也大大减少了qPCR反应的数量。对OT-2的性能进行了测量，包括循环阈值（Ct）值、变异系数（CV）和完成制备所需的时间。

使用OT-2有效地制备了用于qPCR的NGS文库，并使用了两种标准化方法。与标准归一化相比，Normalase方法在自动化流程中更容易实施，整体节省了1小时和20分钟的手动操作时间。与参考试剂盒标准相比，两种方法的Ct值都很好，CV值也很低。