纳米颗粒跟踪分析技术在生物医学中的应用

纳米颗粒跟踪分析技术（简称：NTA），是近年来新兴的纳米级别测量技术之一，原理如图1所示。纳米颗粒在其悬浊液中受到周边溶液分子的撞击而做无规则的布朗运动，然后通过斯托克斯-爱因斯坦方程，这些颗粒在单位时间内 (t_s) 的移动速度（<x,y>²）与其本身的粒度（d_h）、溶液的粘度（Ƞ）和温度（T）存在数量上的关系。因此通过观察溶液中的颗粒运动轨迹，得出与之相关的颗粒粒径数据。同时，通过仪器内置的高速相机和软件，对观察到的每一个颗粒进行跟踪分析，最终提供与常规粒度仪所不同的粒径数量分布以及颗粒物浓度的分析结果。

图1 （左） 纳米颗粒受到溶液分子撞击做无规则的布朗运动        （右）斯托克斯-爱因斯坦方程

在光学显微镜时代，生物医学中通常能够观察到的颗粒或者目标的大小一般从数微米到数十微米不等，但在纳米粒度仪的引入之前，人们就已经意识到未来的研究会趋向更为微观的视角，外泌体、病毒和噬菌体以及生物制品如抗体和疫苗，这些颗粒的粒度都远小于光学显微镜的观察范围；同时，常规生物医学检测方法（如：病毒滴度测试，病毒蚀斑测试，Elisa等）往往只能在宏观上予以相对比较笼统的表达。因此，本文希望通过简单分享近年来纳米颗粒跟踪分析技术的应用，来进一步了解全新的纳米技术是如何在生物医学领域中起到越来越重要的作用。

NTA在外泌体及病毒和疫苗领域的前瞻应用

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小较为均一，直径为30~100纳米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。随着分子技术的不断发展，生物学界对外泌体的探索日趋深入。2013年，三位国外科学家因在细胞膜转运机制的研究上取得关键性突破，被授予诺贝尔生理学或医学奖。由此，外泌体研究达到了一个全新的高度。

而近年来，越来越多证据显示出外泌体对临床治疗的重要价值。外泌体是细胞间信使，通过其数量和生物化学组成的变化，可以为进一步的临床诊断提供有力的证据。它携带多种蛋白质和miRNA，参与细胞信号转导、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程，并且有可能成为药物的天然载体，应用于肿瘤检测或临床治疗。

目前外泌体的检测与观察主要通过电子显微镜完成，电子显微镜通过直接的测量比对，描述外泌体的粒径尺寸并且能够清晰的显示外泌体颗粒的具体结构。当然，这种方法所存在的不足也很明显。由于一次所能观察到的范围有限，因此所获得的粒径分布数据往往不具代表性。同时，电子显微镜的样本，往往需要通过干燥、固定以及冷冻等不同方式进行前处理，这对生物样本的结构会造成一定的破坏，从而最终影响观察的效果。

相对而言，马尔文纳米颗粒跟踪分析仪（简称：NanoSight）所具备的溶液状态（原位测试）下的测试，为外泌体颗粒提供了非常好的结构与功能上的保护，并且能够让外泌体颗粒在更接近其原始状态下进行测量，保证了测量数据的真实性和有效性。此外，其高精度的粒度数量分布测试，甚至可以分辨出相对粒径差异在1：1.5倍左右的颗粒，尤其在生物样本中，颗粒的分布呈现极度不均匀的宽分布状态，一些粒径小数量少的颗粒在分析中容易被常规测量方法所忽略，而马尔文NanoSight提供的数量分布粒度测试有效地解决了这一问题。另外，独一无二的浓度测量技术，直接为外泌体研究人员提供可靠的外泌体浓度数据。目前已得到证明，在不同的生理状态下，外泌体的浓度变化与不同的细胞生长状态和种类有关。

在传统病毒学中，病毒溶液中病毒颗粒的浓度一般通过物理法或者生物学法测试。这其中，物理法通过病毒DNA对光的吸收进行测定，结果非常稳定却无法区分病毒颗粒的种类。生物学方法如GTU、PFU和TCID50等，也存在局限，如测试结果不稳定，不同的操作人员很难能得出相近的结果。

NTA技术通过分析病毒悬浊液中病毒颗粒的布朗运动，使用斯托克斯-爱因斯坦方程，能够快速准确的检测出病毒粒度的数量分布。同时，特有的浓度测试系统提供样本的实时浓度信息。更重要的是，马尔文NanoSight特有的荧光系统，为分辨病毒颗粒的种类提供了极为方便的平台，科研人员可根据自己的需求设计不同吸收波长的荧光染色，从而达到分辨不同种类病毒颗粒的目的。目前有四种荧光波长可供使用，分别为405nm、488nm、532nm和635nm，搭配相应的滤光片，实现荧光样品的测量，再由NTA技术对其进行单独检测，免受复杂样本（如血清、尿液等）环境的影响。

当前，纳米颗粒跟踪分析技术正越来越多的用于生物医学的基础以及临床研究中，同时，在一些生物和药物制剂的生产和质检中，我们也越来越多地看到它的身影。当然，NTA技术不仅在科研领域有所应用，而且已经拓展到了许多生物和医药制品的生产及质检等环节中。

众所周知，在疫苗和抗体的生产、运输和储存过程中，由于环境的改变和条件的限制，往往不能够完全保证产品一直处于最佳的环境。而环境的微妙改变，往往会导致不同程度的小颗粒物团聚。在疫苗和抗体的使用过程中，如果产生的较大颗粒进入人体后，非常容易引起强烈的排异反应，从而可能会产生极为严重的后果。

以蛋白质为主体的疫苗和抗体颗粒，在pH值、温度、溶液成分发生变化时，蛋白质颗粒容易发生结构和表面电位等不同方面的变化，从而导致颗粒之间相互团聚。马尔文NanoSight提供了一个非常全面的测试平台，用户在使用中有充分的自由度来模拟不同情况。由于该平台可同时进样和测试，因此在调整颗粒溶液的测试环境后，用户可以迅速的得到新条件下样本的变化数据。

一般情况下，影响蛋白质产品的最主要环境因素可能是温度。在持续的高温下，蛋白质会产生变性、团聚。为了了解温度对免疫球蛋白IgG的影响，借助马尔文NanoSight的自动温度控制平（平台可控温度为18-55℃

) ，研究人员做了如下测试：将IgG溶液保存在在55℃的恒温状态下，在5mins、15min、20mins、30mins、60mins、120mins、3hrs、4hrs和5hrs分别进行数据和视频的采集。通过比对和数据分析，研究人员发现在55℃的环境温度下，IgG在30分钟左右开始出现明显的聚集现象（具体参考图2）。这也为生产疫苗和抗体的厂家提供了可信的实际数据，从而推断产品在不同状况下的保存时间和要求，预防产品的变质和不正确使用，保障使用过程的高效和安全。

图2 样本温度在55℃的状态下，分别在5mins、15min、20mins、30mins、60mins、120mins、3hrs、4hrs和5hrs采集的视频清楚的呈现了抗体的团聚过程

更多新功能开发，全方位响应客户需求

当然，在应用领域上，NanoSight不仅局限于生物医学领域中，在其他的领域也有广泛的应用，如毒理学研究、材料分子学研究、纳米气泡、墨水、食品等。对此，马尔文NanoSight产品专家梅洁先生表示：“说服客户的不是我们的专家，而是马尔文的产品本身。”

配备了先进NTA检测技术的NanoSight拥有常规粒度仪不具备的强大功能：它能够进行严格的质控，通过对观察到的所有颗粒进行分析和计算，第一时间给出样本粒度的详细分布和浓度的具体信息。尤为关键的是，NTA的工作原理是通过将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品（悬浮颗粒的溶液）进行照射，配以玻璃表面镀铬使背景信号最小化，可让研究人员通过显微镜直接观察到纳米颗粒在溶液中的布朗运动，并拍摄影像，对每个颗粒的布朗运动进行跟踪和分析，快速准确地计算出样本中纳米颗粒的流体力学半径和浓度。相对于其他传统技术，NTA能对悬浮液中粒径分布范围较宽的颗粒进行全方位表征，并且兼具极高的分辨率，对于粒度较为接近的颗粒仍然可以准确分析，特别适用于外泌体、蛋白质聚集、药物传输、纳米颗粒毒理、病毒和疫苗等复杂体系的相关研究。

另外，NanoSight还可以测定颗粒的数量，准确指示样本溶液中单位体积颗粒浓度和颗粒数量，进行以量为基准的粒径测试和分布测试。在目前各种注射剂中，对于悬浊液颗粒数量以及粒径的要求已经越来越严格。

在操作方面，NanoSight大大降低了测试所需的时间和样本量。通常，大型仪器（如流式细胞仪）在使用前都需要进行复杂的预热和校准准备。由于使用斯托克斯-爱因斯坦方程的计算方式，NanoSight无需这样做，它只要连上电源就能直接使用。并且由于NTA技术采用的是一个无需预先知道质量、折光度和颗粒材料的流体力学直径测量技术，仪器可跳过繁琐的标样校准直接进入研究分析，为工作人员节省研究前的时间。

常规情况下，使用流式细胞仪测试一个样本的平均时间为1-1.5小时，而目前使用马尔文NanoSight，每个样本的平均时间约为10分钟，且分析结果全面、可靠。对许多客户来说，这不光节约了大量的时间，加速推进整个科研进程，还为他们节省了宝贵的人力成本。

总结与展望

作为材料及生物物理表征领域的领导者，马尔文不断把顶尖技术带到中国，让客户买到的不只是一个硬件，而是一整套解决方案。除了技术创新，马尔文也一贯注重客户服务，技术团队是公司的主力军，涵盖了学术级专家、应用专家和服务工程师等，始终参与客户的研究工作，深入了解客户需求，提升产品价值。

在生物医学快速发展的今天，许多研究领域在国内尚处于起步阶段，马尔文仪器不断以全新的产品来助推应用和科研进展。随着越来越多的科研机构与研究项目成果的披露，以马尔文NanoSight为代表的新一代NTA技术将会为推进外泌体研究乃至人类健康事业的发展做出更大贡献。希望此文能抛砖引玉，鼓励更多的客户和研究者与马尔文一起探索科研领域的未知数。