NanoSight NS300:外泌体表征利器

NanoSight NS300：外泌体表征利器

外泌体近年来已成为学术界研究热点，如何准确并方便地获得外泌体粒径、浓度、纯度甚至亚型信息呢？在NanoSight NS300还没有被科研人员所熟知前，人们通常采用透射电镜、流式细胞仪、纳米粒度仪来表征外泌体，但上述仪器都或多或少存在一些明显的缺点：进行电镜测试前，外泌体要经过干燥、负染等一系列繁琐的工序，耗时较长，且该方法不是一种原位测量技术，样品在干燥过程中极有可能发生破裂或皱缩，因此不能正确地反映出样品的实际大小，此外，该方法只能观测到有限数量的外泌体，所获得的粒径分布数据往往不具代表性；传统流式细胞仪则无法测量小于300-500nm的外泌体；基于动态光散射原理的纳米粒度仪不适合大小不一，粒径宽分布的复杂外泌体的测量，并且无法获知样品中外泌体的浓度。

图1. NanoSight NS300主机、激光器及微流量注射器泵附件 

NanoSight NS300（图1）的出现，很好的弥补了上述几种仪器的缺点：在整个测量过程中，外泌体是分散在溶液相中的，这保证了外泌体形态的正确性和稳定性；微流量注射泵，可实现短时间内足够有效数目外泌体颗粒的采集，相较于静态单点或多点采集，其使用更方便，且数据更为准确（图2）；专利性的光路系统，CMOS相机及20倍光学镜头使得外泌体的粒径检测下限低至30 nm；单颗粒追踪技术保证了大小不一的外泌体样本能实现准确粒径、浓度测量。 

图2. 微流量注射泵采集方式及静态采集方式数据对比 

除了强大的硬件功能，与之相配套的NTA分析软件也十分优秀。其能提供如下样品信息：平均粒径、主峰粒径以及粒径分布宽度参数；颗粒浓度信息；粒径-数量分布，粒径-光强分布以及粒径-数量-光强三维分布曲线；颗粒分布累积曲线；在不同粒径范围进行浓度计算。除上述信息外，该软件以下两个功能尤为重要：在颗粒路径分析时，可实时显示被跟踪颗粒的路径（图3），这让分析者对结果的准确性更加有信心，并能及时排除假阳性信号对数据造成的影响；对样品测量时存在的震动进行提示并自动进行纠正。

图3. NTA软件颗粒分析界面，可显示每个颗粒的运动轨迹

现如今，NanoSight已成为外泌体粒径、浓度测量的金标准，该仪器通过激光光源照射纳米颗粒悬浮液，可以清晰观察到颗粒的散射光斑，同时NTA软件对每一个颗粒的布朗运动进行自动跟踪，进行运动速率计算，最终得到整个体系的颗粒粒径分布和浓度信息（图4）。全球已有超过700多用户，利用NanoSight发表了1000多篇外泌体相关文章。

图4. NanoSight NS300在散射光模式下测得的外泌体粒径分布图及浓度

由于外泌体分离技术的五花八门，导致了分离得到的外泌体无论从粒径还是纯度都存在较大差异。甚至许多科研人员通过NanoSight的散射光模式测量得到的外泌体样本粒径往往也都在30-200 nm这个范围内，但这不足以保证其纯度，因为许多蛋白聚集体、脂蛋白甚至乳糜微滴也都在这个粒径范围内，如何确保分离得到的是较纯的外泌体，答案是： NanoSight的荧光模式。

图5. 利用CMO荧光染料对待测外泌体进行染色，分别考察其在散射光模式和荧光模式下的粒径-浓度分布 

我们都知道外泌体是一种生物膜结构，其主要构成部分为磷脂双层膜，利用一种名为cellmask orange（CMO）的荧光染料即可对待测样品进行染色，而蛋白聚集体等杂质不能结合该类染料。如图5所示，通过比对散射光和荧光模式下得到的数据，我们可以很容易的得出该样品的纯度高低。此外，SBI公司基于488 nm激光器的NanoSight开发出了相应的荧光kit：ExoGlowTM-NTA Fluorescent labeling kit（图6），利用该kit在NnaoSight NS300上也能完美实现外泌体纯度鉴定。

图6. ExoGlow^TM-NTA Fluorescent labeling kit针对磷脂双层膜疏水区进行标记

最后，外泌体或微囊泡的亚型如何利用荧光模式进行判别和鉴定呢？如图7所示，研究者利用灌流以及超高速离心技术从胎盘分离得到微囊泡，利用NanoSight散射光检测技术得到微囊泡的粒径分布（蓝色线条）。前期大量研究表明，胎盘细胞分泌的囊泡其表面碱性磷酸酶是高表达的，为了论证得到的囊泡是否是来源于胎盘细胞，NDOG2-QD605荧光标记抗体以及做为阴性对照的IgG-QD605被用来和囊泡进行孵育，通过荧光模式进行测定，结果显示分离得到的囊泡绝大多数都是表达有碱性磷酸酶的（红色线条：NDOG2-QD605，绿色线条:IgG-QD605）。

图7. 利用NDOG2-QD605荧光标记抗体特异性修饰胎盘细胞分泌的囊泡进行亚型鉴定 

近年来利用NanoSight的荧光功能发表的外泌体相关的文章，感兴趣的相关研究人员可以借鉴参考：

1. RA Dragovic, C Gardiner, AS Brooks, et al., Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2011, 7:780

2. W Oosthuyzen, NE Sime, JR Ivy, et al., Quantification of human urinary exosomes by nanoparticle tracking analysis. J Physiol, 2013, 591:5833-5842

3. RA Dragovic, GP Collett, P Hole, et al., Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods, 2015, 87:64

4. S Baldwin, C Deighan, E Bandeira, et al., Analyzing the miRNA content of extracellular vesicles by fluorescence nanoparticle tracking. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2016, 13:765 – 770

5. J Wang, Y Zhong, X Ma, et al. Analyses of Endothelial Cells and Endothelial Progenitor Cells Released Microvesicles by Using Microbead and Q-dot Based Nanoparticle Tracking Analysis. Scientific Reports, 2016, 6:24679-

6. W Zhang, P Peng, Y Kuang, et al. Characterization of exosomes derived from ovarian cancer cells and normal ovarian epithelial cells by nanoparticle tracking analysis. Tumor Biol, 2016, 37:4213-4221

7. P Vallabhajosyula, L Korutla, A Habertheuer, et al., Tissue-specific exosome biomarkers for noninvasively monitoring immunologic rejection of transplanted tissue. Journal of clinical investigation, 2017, 127:1375-1391