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布鲁氏菌检测新方法——荧光偏振技术

发布时间: 2021-04-09 17:33:03 来源:美谷分子仪器

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2019 年 11 月 28-29 日,中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控技术团队先后报告有 4 名学生布鲁氏菌病血清学阳性[1]。随着检测范围的扩大,截至 2020 年 11 月 30 日,当地累计检测 79357 人次,重复检测 10786 人次,实际检测 68571 人,经省疾控中心复核确认,抗体阳性人员 10528 人 [2]


经专家组调查,2019 年 7 月 至 8 月,中牧兰州生物药厂在兽用布鲁氏菌疫苗生产过程中使用过期消毒剂,致使生产发酵罐废气排放灭菌不彻底,携带含菌发酵液的废气形成含菌气溶胶,扩散后导致人体产生抗体阳性 [3]

布鲁氏菌病简介

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种变态反应性人畜共患传染病,其主要感染牛、羊、猪、犬、鹿等哺乳动物。在我国大部分地区羊是主要感染源,其次是牛和猪。布鲁氏菌可以通过破损的皮肤、黏膜、消化道和呼吸道等途径传播。染疫的家畜是人间布病的主要传染源,人由于接触患病的牲畜及其产品或其污染物而感染布病。布病主要损害人、畜的生殖系统和关节,对畜牧业的发展以及人类健康产生了较大的危害。目前布病是《中华人民共和国传染病防治法》规定的 35 种传染病中的乙类传染病,并被列为二类传染病。


布鲁氏菌病现行诊断方法及比较

由于布病的发生、发展和转归比较复杂,其临床表现多种多样,很难以某一种症状来确定诊断。对布病的诊断,需要结合患畜或病人的流行病学史、临床症状和实验室检查等情况来综合诊断。及时、准确地诊断布病是控制和根除布鲁氏菌病的关键。现如今,我国对于动物和人类布病的实验室诊断方法大体分为两类:一类是以检测布鲁氏菌抗原免疫反应为主的血清学诊断,另一类是证明病原体存在的病原学诊断,具体的诊断方法见下面表格 1 和表格 2。


表格 1 动物布病实验室诊断方法 [4]

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初筛试验

确诊试验

血清学诊断

虎红平板凝集试验(RBT)(GB/T  18646)

试管凝集试验(SAT)(GB/T  18646)

数学

全乳环状试验(MRT)(GB/T 18646)

补体结合试验(CFT)(GB/T  18646)

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)

竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)

荧光偏振试验(FPA)*

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病原学诊断

显微镜检查

PCR

细菌分离培养

细菌鉴定

*农业部国家卫生计生委发布的《国家布鲁氏菌病防治计划(2016-2020 年)》中将 FPA 列为初筛试验


表格 2 人类布病实验室诊断方法 [5]

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初筛试验

确诊试验

血清学诊断

虎红平板凝集试验(RBT)

试管凝集试验(SAT)

胶体金免疫层析试验(GICA)

补体结合试验(CFT)

酶联免疫吸附试验(ELISA)

抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)

病原学诊断

布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布鲁氏菌

从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物等任一病理材料培养物中分离到布鲁氏菌

诊断布鲁氏菌病的“金标准“普遍认为是分离和鉴定病原,而布鲁氏菌在体外生长非常缓慢,一般需要培养几天甚至数周才能出结果,并且该试验需要在生物安全三级实验室,由经验丰富的技术人员来完成,所以该试验不适合现场的即时诊断或者疫情需要控制时的快速诊断。


PCR 方法因其具有速度快、灵敏度高和安全等优点,越来越多的被应用于人类和动物的感染诊断,但是布鲁氏菌 PCR 检测在不同实验室之间表现不一致,对样品制备程序、基因组靶标的选择、检测技术等重要技术方面还没有形成标准化 [6]


与培养法和 PCR 法相比,从技术角度来看,血清学诊断方法比较经济和相对简单,更适合进行大规模的筛查和诊断,特别是在流行地区。传统的血清学诊断方法也有各自的优缺点,如试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)等耗时较长、方法繁琐且判断较为困难,结果判定非常依赖于技术人员的经验;虎红平板凝集试验(RBT)虽然操作简单,几分钟内就能得到结果,但它的高灵敏度对接种疫苗的动物会产生假阳性 [7],在交叉反应细菌感染的患者中也会产生假阳性反应 [7];酶联免疫吸附试验(ELISA)虽然具有较高的特异性和敏感性,但试验过程需要多次洗涤和孵育,对操作人员专业要求高且步骤耗时较长。


虽然这些不足在很大程度上可以通过联合使用多个血清学试验来克服,但人们一直在寻求一种快速、简便、经济且更准确的布鲁氏菌病检测方法。


新兴的布病检测方法

荧光偏振试验(FPA)

1

荧光偏振试验(FPA)的原理

荧光偏振试验(FPA)是一种抗原/抗体相互作用的简单技术,该试验基于物理原理:在溶液中,分子的旋转的速度与其质量有关。小分子的自旋速度较快,从而使光快速去极化,测得的偏振值较低,而大分子的旋转速度较慢,因此对光的去极化更少,测得的偏振值较高。FPA 以毫偏振单位(mP)来衡量去极化的程度。


在测试期间,将血清样品与被荧光染料标记的抗原小分子孵育,在布鲁氏菌属的抗体的存在下,形成了大的荧光复合物。在阴性样品中,抗原是未结合的状态,与布鲁氏菌属阳性样本相比,这些较小的抗原分子旋转得更快,因此引起光的更大去极化。

荧光偏振技术原理


2

荧光偏振试验(FPA)的工作流程

该试验操作很简便,将试剂盒提供的阳性对照、阴性对照及待检血清加入到 96 孔纯黑色微孔板中,再加入样品稀释液对各样品进行稀释,接着在 MD 荧光偏振仪上读取对照品和样品的空白值,之后加入示踪剂(荧光染料标记的抗原)并混合孵育,然后再次在 MD 荧光偏振仪上读取试验值。在 MD 荧光偏振仪的 SoftMax Pro 软件里,空白值和试验值均包括垂直和水平两个方向上的偏振光强度,应用试验值减去空白值之后的 Delta FP 值来计算毫偏值(mP),mP 值的计算公式如下:

其中 S 是水平方向上的 Delta FP 值,P 是垂直方向上的 Delta FP 值,G 是荧光测量路径的校正因子,在 SMP 软件中 G 因子可以通过计算或者手动方式来进行调节 [9]


最后用样品的 mP 值减去阴性对照平均 mP 值得到的 Delta mP 值,再根据试剂盒给出的截断值进行结果判定。上述的测试程序、数据分析和结果判定都能够在强大的 SoftMax Pro 软件中完成,并能够生成、打印和导出 PDF 格式的试验报告,而且报告格式支持个性化定制。

目前,国内已有动物布鲁氏菌病荧光偏振抗体检测试剂盒,进口试剂盒选择种类较多,包括动物和人的布鲁氏菌病荧光偏振抗体检测试剂盒。


3

荧光偏振试验(FPA)的特点

荧光偏振试验(FPA)作为新兴的布鲁氏菌病检测方法,事实上它在人类医学中已经使用了很多年 [6]。世界动物卫生组织(OIE)在 2016 年批准了 FPA 法用于牛布病的验证诊断以及羊和猪布病的检测 [8],并且欧盟和美国农业部也批准 FPA 法用于各国进出口贸易时牛群的检测。在我国,荧光偏振试验(FPA)也在现行的《国家布鲁氏菌病防治计划(2016-2020 年)》中被列为动物布病的初筛试验。


它是一种均相检测方法,整个试验都在溶液中进行,没有分离和洗涤步骤,因此非常快速,可以在实验室或现场进行。与前述的传统血清学诊断方法相比,荧光偏振试验(FPA)操作简便,能够快速给出结果(几分钟内),在实验室和仪器之间具有高度的可重复性。整个测试都是在荧光偏振仪上进行,试验结果很客观,减少了凝集试验结果判读时易发生的人为错误和可变性。


此外,传统血清学检测方法的抗原大都是布鲁氏菌细胞膜上的光滑脂多糖(S-LPS),而 FPA 的抗原分子使用的是光滑脂多糖(S-LPS)中最具有免疫原性优势的 O-多糖(OPS),这使得 FPA 法能够区分免疫动物和自然感染动物,疫苗免疫后动物体内残留的抗体滴度能够被检出,抗体水平非常低,而自然感染动物体内抗体水平高。基于以上优点,荧光偏振试验(FPA)很适合大规模布鲁氏菌病的筛查和检测,值得推广。


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参考文献

[1]兰州兽医研究所疑似人畜共患病通报:65人呈阳性,  网易新闻

[2]兰州布菌抗体阳性事件追踪:抗体阳性10528人, 每经网

[3] 兰州兽研所181例布病抗体呈阳性原因查明:疫苗生产使用过期消毒剂, 央视网

[4]动物布鲁氏菌病诊断技术,GB/T 18464-2018

[5]布鲁氏菌病诊断,WS 269-2019

[6] Pablo Yagupsky, Pilar Morata, Juan D. Colmenero. Laboratory Diagnosis of Human Brucellosis. Clin Microbiol Rev 33:e00073-19.2019

[7] MJ Saavedra, C Fernandes, etc. Laboratory Diagnosis of Brucellosis. Brucellosis in Goats and Sheep: an endemic and re-emerging old zoonosis in the 21st century. New York: Nova Science publisher. p. 151-180. ISBN 978-1-53614-962-3.

[8] OIE. World  Organisation  for  Animal  Health.  Brucellosis  (Brucella abortus,  B.  melitensis and B.  suis)  (Infection  with B.  abortus,  B. melitensis and B. suis). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals; 2016.

[9] Establishing and optimizing a fluorescence polarization assay,  Techanical Note, Molecular Devices.



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