使用自动延时成像功能评估血管生成

血管生成试剂盒中提供正常人真皮成纤维细胞和表达 GFP 的正常人脐静脉内皮细胞。按照试剂盒的说明，将正常人真皮成纤维细胞 (NHDFs) 在培养基中解冻并复苏。复苏后，将含有 NHDFs 的离心管在 200 x g 条件下离心 4 分钟。然后去除上清液，并将 NHDF 细胞沉淀重悬于 12 mL 完全培养基中。将 100 μL 的 NHDF 细胞悬浮液接种到 96 孔黑壁透明板中，将板在超净台中于室温下孵育一个小时，使细胞沉降。将表达 GFP 的人脐静脉内皮细胞 (GFP-HUVEC) 以每孔 100 μL 的浓度接种在 NHDF 层上面，然后将板在超净台中再孵育一个小时， 以使 HUVEC 沉降。将板放入 37 ℃ 培养箱中放置 4 个 小 时，然后在 ImageXpress Pico 系统中获得第 0 天的读数。

第二天，从每个孔中移出旧培养基，并添加 150  μL 完全培养基到每孔中。在第二天进行第一次化合物刺 激，在第四天和第七天分别第二次和第三次化合物刺激。化合物溶液需要在温热的完全培养基中制备。用血管内皮生长因子 VEGF 来刺激 HUVEC 细胞中的血管生成。VEGF 工作溶液按 1：4 稀 释，从 16 ng/mL 降至终浓 度 0.25 ng/mL。为了测试已知的抗血管生成化合物的抑制作用，在 VEGF 存在下将苏拉明或雷帕霉素加入孔中。将苏拉明和雷帕霉素的 2X 工作溶液与 2X VEGF 溶液一起添加到孔中。血管生成抑制剂治疗以 1：4 稀释，每孔中 VEGF 的终浓度为 4 ng/mL。苏拉明的终浓度为由 80 μM 降至 1.25 μM，雷帕霉素的终浓度由 1.2 nM 降至 0.018  nM。

使用集成环境控制的 ImageXpress Pico 系统进行活细胞成像，环控参数为 5% CO₂、20% O₂、85% 湿度和 37 ℃ 温度。在 ImageXpress Pico 系统中进行不连续的延时成像采集，放回培养箱中，直到下一个成像时间点。培养后一小时获得了第一个时间点；培养后 12 小时捕获第二个时间点；24 小时捕获第三个时间点。然后在接下来的 9 天中，每 24 小时对板成像一次。在明场和 FITC 通道中，以 10 倍物镜捕获了每个孔的 9 个位置，每个孔的有效成像约 35％。通过使用“ 通过使用无缝拼接程序 ”，无需手动配置即可即时拼接图像。FITC 通道图像也是通过动态 2D 反卷积获取的，曝光时间为 200 毫秒。明场图像的曝光时间为 10 毫秒。

利用 CellReporter Xpress 软件中预先配置的血管生成分 析模块来识别和测量血管生成网络的发展。用户只需少 量输入，分析模块即可在整个分裂、生长和管形成过程中 准确分割 HUVEC 细胞。经过优化，分析设置可识别至少 4 μm 的长而细的微血管 ( 图 1 和 2 )。

这种最小宽度的划分确保了小细胞、非成管物体和碎片在分析中不会被检测到。指示 HUVEC 细胞分裂和生长的大块细胞被鉴定为细胞结 ( 图 1D )。此外，定量测量可以有效评估促血管生成化合物和抗血管生成化合物的效果，包括平均和总共的管长和面积，每组管长，节点数，段数和分支点。本应用介绍了每组测量的管长，以说明 VEGF 和抗血管生成化 合物对 HUVEC 细胞管形成的影响 ( 图 2 和 3 )。

Figure 1 使用 ImageXpress Pico 系统自动成像并分析血管生成。(A–B) 在明场中拍摄图像，用可视化成纤维细胞和 HUVEC 细胞共培养，同时用 FITC 通道对表达 GFP 的 HUVEC 进行成像 ( 绿色 )。(C–F) CellReporter Xpress 软件中的血管生成骨架分析模块在整个延时实验中识别并测量了管网 的形成。CellReporterXpress 软件中的血管生成分析模块在整个延时实验过程中识别和测量管网络的形成。分析模块识别和测量血管生成管 ( 白色 )， 管网骨架 ( 橙色 )，分支点 ( 蓝色 )，以及分裂和生长的细胞簇 ( 紫色 ) (D，F)。

监测促血管生成因子作用的能力对于开发抗缺血性疾病 的药物以及理解血管生成在发育和伤口愈合中的重要作 用具有重大意义。基本的信号分子，包括关键的生长因子，调节着血管网络的生长和发育。^2,3 在这个活细胞体外 实验中，我们使用被称为内皮细胞关键促血管生成生长 因子的 VEGF 刺激血管生成。HUVEC 细胞显示出一个基线水平的管生长和形成，加入 VEGF 后立即反应。在第 2 天添加生长因子，以及后续的每次添加后，血管长度均出现明显的峰值 ( 图 3 )。但是，对于最高浓度的 VEGF  (16 ng/mL)，添加第 7 天后每组血管长度的增加可以忽 略不计。16 ng/mL 和 4 ng/mL VEGF 对血管网形成的刺激最大，而最低的两个浓度分别为 60% 和 40%。

抑制血管生成一直是各种疾病治疗发展的重点，包括各种癌症、炎症和退行性疾病，目前市场上有几种抗 VEGF 疗法，用于治疗某些癌症和年龄相关性黄斑变性。³ 为了呈现 VEGF 介导的血管生成的抑制作用，我们测试了不同浓度的两种间接血管生成抑制剂，通用的酪氨酸激酶抑 制剂苏拉明，以及 mTOR 抑制剂雷帕霉素，并添加了 4 ng/mL 的 VEGF。与 4 ng/mL VEGF 对照相比，苏拉明和雷帕霉素都对 HUVEC 管的形成产生负面影响，从而导致管长度缩短 ( 图 2 和 3 )。

血管生成的抑制明显是剂量依赖性的。测试的化合物浓度都抑制了 HUVEC 细胞达到最大值，可以看出，与 4 ng/mL VEGF 对照相比，这些治疗组的细胞每组设置值的管长更小。当苏拉明的浓度为 80 μM 时，其抑制效果达到峰值。