在ImageXpress Micro 系统上使用 EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 试剂盒进行细胞凋亡检测

简介

凋亡是一种重要的机制，可向胚胎发育等正常过程以及癌症和神经退行性疾病等疾病过程中的细胞发出程序性死亡的信号。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 检测试剂盒可通过使用 NucView 488 Caspase-3 底物检测完整细胞群内的凋亡。该底物由荧光 DNA 染料偶联 caspase-3/7 DEVD 识别序列组成。最初是非荧光的，它会渗透细胞膜。如果细胞是凋亡的，底物会被 caspase-3/7 裂解，释放出进入细胞核并与 DNA 结合的染料，从而产生亮绿色荧光。细胞可以活细胞成像，无需洗涤步骤即可去除死细胞或凋亡细胞，但染料在固定后也会被保留。

这种灵活的检测可使用 ImageXpress® Micro 高内涵成像系统和 MetaXpress® 分析软件进行，以计算孔中凋亡细胞的发生率。 

材料

• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 检测试剂盒（Explorer Kit Cat. No. R8350 or Bulk Kit Cat. No. R8351, DMSO formulation）

• CHO M1WT3 细胞

• Camptothecin喜树碱

• 384 孔黑色透明底微孔板 （Corning Falcon）

• DRAQ5 核染色

• ImageXpress Micro 高内涵成像系统

检测方法

CHO 细胞以每孔 3，500 个细胞、每孔 50 μL 的密度接种于经 384 孔组织培养处理的微孔板中。允许它们在37°C、5% CO2的培养箱中附着并生长过夜。然后，将孔用从 100 μM 至 0.1 μM 的 1：2 梯度稀释的喜树碱（抗癌药物）处理 24 小时，诱导凋亡。

在温暖的培养基中制备了 10 μM 2X NucView 488 底物工作溶液。从每个孔中小心抽吸 25 μL，并替换为 25 μL 2X 底物溶液，最终浓度为 5 μM。将细胞在 37°C 下孵育 1 小时，之后

以 10 μL 的量向每个孔中加入 6X DRAQ5 核染料溶液，最终浓度为 2 μM。孵育 30 分钟后，使用 FITC 和 Cy5 滤光片组以及 10X Plan Apo 物镜在 ImageXpress Micro 系统上读取孔板（图 1）。在此放大倍数下，一个视野通常捕获 1，1001，400 个细胞核，以便一个图像产生统计学相关结果。

图 1：NucView Caspase 3/7 染色细胞（绿色）和 DRAQ5 核染色（红色）的图像叠加。（顶部）经 50 μM 喜树碱处理的细胞表现出高凋亡细胞核发生率。（底部）未经处理的对照组显示很少有细胞核具有凋亡染色。

数据分析

将在 ImageXpress Micro 成像系统上拍摄的细胞，使用细胞分类模块在 MetaXpress 软件中进行分析。通过直观的用户输入，该模块可识别 DRAQ5 染色细胞核作为总细胞计数，并将Caspase 3/7 阳性细胞核分类为凋亡细胞核。可评估如核大小、强度和凋亡百分比等多个参数。如果对化合物暴露产生的总毒性干扰凋亡评估，则分析中可省略细胞计数低于特定数量的孔。

结果

绘制凋亡细胞百分比与喜树碱浓度的关系图并应用 4 参数曲线拟合，得到 EC5₀ 值为 5.7μM 的浓度反应曲线（图 2）。EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 检测试剂盒与 ImageXpress Micro 系统和 MetaXpress 软件配合使用，可为科学家提供快速、可靠的基于图像的细胞凋亡定量。

细胞凋亡成像分析

喜树碱 （μM）上图无纵坐标解释，需添加

图 2. 经喜树碱处理的 CHOm1 细胞的剂量-反应曲线。 凋亡细胞（绿色荧光）和所有细胞核（红色荧光）在图像中被识别，并使用 MetaXpress 软件进行计数。绘制了凋亡细胞的百分比。EC₅₀ = 5.7 μM。

兼容此 Molecular Devices 系统

ImageXpress Micro 高内涵
成像系统