通过对肿瘤细胞球的高通量共聚焦成像筛选癌症治疗方案

简介

近年来，在开发肿瘤细胞体外聚集体以用作体内组织环境模型方面取得了显著进展。当接种至超低黏附圆底微孔板的一个孔中时，这些聚集体会形成一个离散的细胞球。细胞球被认为可比常规二维 (2D) 细胞培养更有效地模拟肿瘤行为，因为它们与肿瘤非常相似，同时包含表面暴露和深埋的细胞、增殖和非增殖细胞，并包含具有一个充分氧化的细胞外层和缺氧中心。此类 3D 细胞球模型已成功用于环境筛选以鉴定潜在癌症治疗方法。开发可靠细胞球检测的一些挑战：

• 定位并聚焦于每个孔中的细胞球，以便在单个视野中对其进行成像

• 优化化合物和染色处理，以确保染料渗透并避免干扰细胞球的放置

• 在整个 3D 结构中采集代表性图像，最大程度减少成像平面上方和下方的离焦或背景信号

• 快速分析图像以产生有意义的结果，从而得出结论

优势

• 以 20x 放大倍率在一个视野中捕获整个细胞球

• 以 96 孔或 384 孔形式筛选生物相关的 3D 细胞球

• 使用共聚焦成像精确检测细胞应答

• 通过仅保存 Z 平面图像的 2D 重构来节省存储空间

细胞球形成和处理

我们使用以下方法从癌细胞系 HCT116, DU145 和 HepG2 中形成细胞球。将细胞在 37°C 和 5% CO₂ 的烧瓶中培养，然后分离并接种到 96 或 384 孔黑色板中，孔底为透明底部 U 形孔（分别为 Corning 4520 和 3830），密度为 1000-1500 个细胞/孔，在适当培养基中补充胎牛血清 （FBS）。在 24 小时内，每个孔底部形成单个细胞球，并在 37°C 和 5% CO₂ 条件下 继续生长2-4 天，直至用于实验（图 1）。细胞球的培养时间可能更长，但大小的增加可能会阻碍染色渗透和中心大多数细胞的成像。本应用说明描述了用于确定抗癌化合物作用的测定方法：依托泊苷、紫杉醇和丝裂霉素 C。细胞球处理首先将 10 倍浓度的化合物添加到孔中，然后孵育 1-4 天，具体取决于正在研究的机制。较短的时间用于研究细胞凋亡，较长的时间用于多参数细胞毒性研究。对于超过 2 天的药物治疗，化合物每 2 天以 1 倍浓度更新一次。 

细胞球染色和成像

此处显示的示例来自开发 HCT116 细胞球测定法，用于评估除孔中凋亡细胞发生率外的细胞球形态变化。化合物处理完成后，将染色剂以 4-6 倍浓度合并成单一混合物，并直接添加到孔中的培养基中。选择免洗染色剂以避免干扰细胞球。

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像系统以 10X或 20X的放大倍率观察细胞球。为了分析整个 3D 结构中的细胞应答，从细胞球体内的不同深度收集图像，以创建图像的“堆栈”。然后使用数学算法将该图像堆栈组合或“折叠”成单个 2D 投影图像。在这种情况下，使用 MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件的最大投影算法生成折叠图像，该算法可使堆叠中的像素保持最亮的强度以生成投影（图 2）。

ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统可生成更清晰的图像，以实现更准确的分割

共聚焦光学器件能够对比宽场光学器件更薄的细胞球光学切片进行成像。这可显著减少被采集平面上方和下方的荧光发射物体产生的背景模糊。它还允许在亚细胞层面或在彼此聚集或堆叠的细胞之间更好地解析精细细节，因为它们处于 3D 结构中。使用共聚焦图像通常可实现更准确的分割。在使用细胞球的重复实验中，宽场图像的细胞核分割比共聚焦图像中计数的细胞核低约 20%（图 3）。

图 1：在高通量筛选环境中检测细胞球的工作流程 单个细胞球可在 96 或 384 孔板中生长，用化合物处理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，还可以固定细胞球。（右）使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统上的延时采集在 63 小时内拍摄 HCT116 细胞的透射光图像，以显示细胞球的形成（10 倍物镜）。

图 2.  在横跨细胞球深度约一半的 z 平面中采集共聚焦图像堆叠（左）。在任何给定平面上，只有细胞球的某些细胞处于焦点中，因此，为了便于分析，图像被折叠成单个 2D 图像，以组合焦点内区域（右）。

使用凋亡检测筛选抗癌药物

一类抗癌药物靶向细胞凋亡的外在途径，以触发细胞死亡。为了展示细胞凋亡的测定，用 4 种不同抗癌化合物的系列稀释处理在 96 孔板中培养 3 天的 HCT116 细胞球 24-48 小时。化合物处理完成后，使用 Life Technologies 的 CellEvent Caspase 和 MitoTracker Orange 试剂检测细胞凋亡。将包括 Hoechst 核染料在内的 4 倍混合染料添加到孔中的培养基中。选择免洗染料以避免干扰细胞球（图 4）。 

图 3.  （顶部）使用宽场光学器件拍摄的 HCT116 细胞球的 15 张图像的Best focus投影。软件分割计数 817 个细胞核。 

由于细胞球边缘的失焦荧光和中心检测不佳的较暗的细胞导致失真，因此细胞核被遗漏。（底部）使用共聚焦光学器件拍摄的 HCT116 细胞球的 15 张图像的Best focus投影。计数更加准确，共1078 个细胞核。

用于多参数凋亡检测

的染色剂        目的        最终浓度

图 4.  （顶部）用化合物处理的 96 孔板中 HCT116 细胞球的图像缩略图的蒙太奇，以 10X Plan Fluor 物镜成像。Hoechst 染色的细胞核（蓝色）被 CellEvent Caspase 3/7 凋亡标记物（绿色）覆盖。未处理的对照在第 4 列，Caspase 3/7 应答在第 5-7 列明显，其中紫杉醇在A 行从 1 μM 按 1：3 的比例连续稀释（3个交叉重复）。（左）将十一个 z 平面合并为 2D 最大投影图像，并使用简单的自定义模块进行分析。原始图像展示了低水平和高水平的细胞凋亡及其相应的分割掩膜（宝蓝 = 胞核，粉色 = 凋亡细胞）。（右）通过标准化细胞凋亡量与未处理的细胞球相比并绘制图表，可以看出紫杉醇（绿线）在比丝裂霉素 C 或依托泊苷低得多的浓度下诱导了细胞凋亡。

图 5.  抗霉素 A 对线粒体的毒性作用。（左图）Hoechst（蓝色）和 MitoTracker（橙色）细胞球的叠加图像，经 1、22、67 和 200 nM 浓度递增的抗霉素 A 处理。（右）细胞球内识别的线粒体平均强度值图说明了药物的作用。

在筛选中对线粒体膜电位进行多重检测

在上面的凋亡筛选中，线粒体膜电位也可以通过将 MitoTracker Orange 添加到染料混合物中来评估。或者，可以单独研究通过影响线粒体代谢来抑制肿瘤生长的药物。下文展示了使用抗霉素 A 进行的测定，抗霉素 A 是线粒体膜电位的一种有效干扰物。经过 4 小时处理后，根据细胞球内 MitoTracker Orange 的强度可检测到线粒体健康。MitoTracker 要么没有完全穿透到大细胞球的中心，要么中央的细胞没有健康的线粒体，正如图像中线粒体波长通常呈调暗的内部所指出的那样（图 5）。

迅速筛选微孔板中的 3D 细胞球

体内 3D 培养系统能够产生大小一致的人癌细胞球，并且能够使用自动化高通量、高内涵成像筛选细胞球对治疗的反应，这是促进化疗候选药物进行更相关检测的重要步骤。ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统和 MetaXpress 软件可对微孔板中的 3D 细胞球进行快速成像和分析，以监测抗癌药物诱导的凋亡和线粒体毒性。

有关优化这些细胞球筛选检测的采集参数的更多信息，请参阅论文：

Sirenko, O. et al., High-Content Assays

for Characterizing the Viability and Morphology of 3D

Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development

Technologies, 2015 In Press.