新型 AdvanceBio 酰胺 HILIC 色谱柱，一键实现多聚糖分离分析

糖基化通常作为生物治疗药物的关键质量属性（CQA）或产品质量属性进行监测。亲水相互作用色谱（HILIC）是用于游离 N- 糖分析的主要色谱柱技术。

具有复杂 N- 糖图谱的蛋白质进行 HILIC 分离分析时仍然存在技术挑战，如关键多聚糖对的共洗脱（图 1）。特别是使用荧光检测器（FLD） 时，多聚糖共洗脱会对多聚糖相对定量带来挑战，只能通过大幅延长 HILIC 梯度时间来解决。

图 1. InstantPC 标记的西妥昔单抗 N-糖的 LC/FLD 色谱图 (A)。根据 MS 数据生成的提取化合物色谱图显示，荧光曲线中的其他多聚糖峰不明显 (B)

▷ 通过改变流动相浓度来调节电荷基团选择性的色谱柱

为了解决上述问题，安捷伦开发了新型 AdvanceBio 酰胺 HILIC 色谱柱。这款色谱柱基于酰胺键合相，同时在工艺上使得其对流动相例子强度的变化做出响应。因此可以通过调节流动相离子强度来改变带电糖型的分离和选择性（图 2）。

图 2. AdvanceBio Amide HILIC 色谱柱可以通过调整流动相离子强度调节带不同电荷聚糖之间的选择性（Neutral/S0 指不带唾液酸，S1 指带 1 个唾液酸，S2 指带 2 个唾液酸；上图：流动相A -  100 mM 甲酸铵，pH 4.4， 流动相 B – 乙腈；下图：流动相 A -  50 mM 甲酸铵，pH 4.4， 流动相 B – 乙腈）

▷ 比其他酰胺色谱柱对带电糖型（唾液酸糖型）具有更高的选择性的色谱柱

在与 Waters Premier BEH 糖类酰胺色谱柱（2.1 × 150 mm, 1.7 μm，货号 186009524）的头对头比较中，为了进一步降低差异并缩短液相色谱分离的前处理时间，向 1L MS 级水中加入一瓶（10 mL）Agilent AdvanceBio 甲酸铵 HILIC 流动相浓缩液（货号 G3912-00000），制得流动相缓冲液。

西妥昔单抗色谱图（图 3）很好地反映出 AdvanceBio 酰胺 HILIC 色谱柱对不同电荷多聚糖分离能力增强的益处：虽然两种色谱柱提供了相近的分离结果，但即使采用源自 MS 的色谱图，FA2G2S1(NeuGc)/FA2G2Ga2 在竞争色谱柱上可能也很难区分，因为 FA2G2S1 的 [M+H+NH4]2+ 离子与 FA2G2Ga2 的双质子化加合物仅相差 5 ppm，这种相似性可能导致鉴定多聚糖时峰面积计算发生混淆。

图 3. Agilent AdvanceBio 酰胺 HILIC 色谱柱 (A) 和 Waters Premier BEH 酰胺色谱柱 (B) 上的 InstantPC 西妥昔单抗分离结果

研究表明，这款新型色谱柱相比于市场上其他领先色谱柱而言，能够提供更具有竞争力的性能，同时还能增强对带不同电荷的多聚糖的分离能力。