基于质谱的单分子免疫分析

基于质谱的单分子免疫分析

单分子免疫检测技术代表了下一代免疫诊断技术发展的主流方向，受到科研领域和临床领域市场的广泛关注。单分子免疫是继放射免疫、酶联免疫和发光免疫之后，出现的新一代免疫分析技术，以Digital-ELISA 为代表。David Walt 是这一技术的发明人（https://doi.org/10.1038/nbt.1641），他不仅发表了系列论文，还研制了全自动单分子免疫检测仪，为超低丰度生物标志物（神经系统退行性疾病如阿尔兹海默病，眼科疾病如眼底病变的诊断）的检测做出了贡献。

图1  基于微孔阵列的数字ELISA

从公开发表的文献看，Digital-ELISA借用了Digital-PCR概念，但缺少类似于PCR扩增的策略，使单分子检测对仪器要求颇高。为提高灵敏度，不少研究者最近也想出了一些办法，包括基于酪胺信号放大的Digital ELISA方法、基于滚环放大的Digital ELISA方法、以及基于CRISPR/Cas12a放大的Digital ELISA的放大方法等。这些技术虽能显著提高检测的灵敏度，但也带来了操作程序上的冗繁。此外，Digital-ELISA为实现单分子免疫，在样本稀释流程、上样方式和设备通量等方面，都还有不少需要提升的空间。该技术复杂的技术路径，和试剂耗材的成本较高，也使其在推广应用方面增加了难度。

为解决上述问题，David Walt在坚持多年微液滴技术之后，也开始考虑相对较为容易的单颗粒流式型的Digital-ELISA策略（David Walt et al, ACS Nano 2022, 16, 1025）。从其发表的论文看，基于荧光微球的流式型单分子检测模式，无需微液滴制作程序，装置相对简单，操作程序和试剂盒的成本也可显著降低。但用两种荧光染料浓度比差异来编码小球，因染料化学性质差异导致掺杂时浓度比值精确控制不易；加之在固体表面检测单分子荧光，杂散光信号严重，背景也较高；荧光探针又属于分子光谱，存在光谱交叠干扰，因此，这个技术在多指标检测中使用起来并不容易。

图2  基于微液滴的数字ELISA

相比之下，基于ICP-MS的单颗粒质谱模式，在单分子免疫分析方面有独到的优势。首先，该技术采用同一稀土元素的两个稳定同位素（如Eu 151/153）浓度比的差异进行编码，由于质谱对同位素比值测量的精确性，使得编码微球的数量大大提升；鉴于同一元素的两个稳定同位素的化学性质高度一致，掺杂与控制程序也极为容易；加之单颗粒ICP-MS技术已十分成熟，远较基于荧光的单分子免疫分析更容易普及。

这种基于ICP-MS的单颗粒质谱免疫分析方法2009年由清华大学张新荣课题组在国际上率先提出（A New Strategy for Highly Sensitive Immunoassay Based on Single-Particle Mode by ICP-MS, JASMS, 2009, 20(6), 1096），此后得到国内外学者的不断丰富和发展。由于质谱在多指标分析方面的特长，该技术在单分子蛋白质、核酸以及其它生物分子的多指标同时分析方面有原理和技术优势。加之国内谱育公司等多个仪器厂商都已开始生产单颗粒ICP-MS仪器，因此该技术的市场普及优势也十分明显。

图3  基于单颗粒质谱的免疫分析

为更好地促进该技术的应用和推广，最近北京清分稳同科技公司已开始研发多款基于该技术的单分子免疫试剂盒，可进行高灵敏、多组分及成像分析，可与国内外任何具有单颗粒/单细胞功能的ICP-MS配套使用。

图4  单分子ICP-MS免疫分析的编码策略

北京清分稳同科技有限公司（BEIJING TASI Technology CO.,LTD.）

北京清分稳同科技有限公司由多位清华大学博士于2019年在北京中关村生物医药园注册成立，是一家为生命科学和临床检测提供先进研究工具的高科技公司，一直专注于质谱平台配套试剂盒的研发、生产和服务。

目前，公司以核心技术平台ICP-MS（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry）搭建了多个应用平台，其中包括临床微量元素检测平台，体液免疫多指标联检平台以及单颗粒/单细胞流式分析平台。

北京清分稳同科技有限公司  孙公伟

作者简介：

孙公伟，清华大学博士。2014年师从张新荣、张四纯教授正式进入实验室，从事质谱分析方法学、临床质谱免疫新方法的研究。以一作身份和通讯作者身份累积发表SCI论文十余篇，申请/授权国家发明专利多项。2019年因研究的相关成果获得投资，组建成立北京清分稳同科技有限公司。作为公司副总经理负责临床质谱免疫诊断试剂盒的研发、生产及医疗器械注册证申报，具有丰富的研发、生产、管理和注册经验。

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