细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg) 的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。自噬作为时下的研究热点，有非常深远的研究意义。拓普生物在自噬研究方面具有丰富的经验，我们可以为您提供从课题设计-实验操作-实验结果-数据分析的整体解决方案。

（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's 平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制剂
5）Rapamycin：mTOR 抑制剂(这是最常用的)
6）Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂

图片来源：Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017 Dec;21(24):5548-5556

（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）

（三）细胞自噬形态学特征的检测方法

1）透射电镜观察自噬体。
自噬体是自噬的标志性结构。自噬体属于亚细胞结构，直径一般为300～900nm，平均500nm，普通光镜下看不到。通过透射电子显微镜发现自噬体一直是观察自噬现象最直接、最经典的方法，是自噬检测的“金标准”。

图片来源：Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017 Dec;21(24):5548-5556

2）荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成。
由于自噬体膜形成过程中需要LC3，因此通过标记LC3可以识别自噬体。


                图片来源：Onco Targets Ther. 2018 Apr 9;11:2017-2028

3）荧光染色法
用荧光染料对组织切片或细胞进行染色观察自噬的发生。晚期自噬体与溶酶体融合而呈酸性，根据这个特点可用酸向性染料MDC、吖啶橙和Lyso Tracker标记自噬溶酶体。

MDC染色法观察自噬  图片来源：Acta Pharmacol Sin. 2016 Apr; 37(4): 505–518

(四)自噬标志性蛋白

1.自噬标记蛋白LC3微管相关蛋白1轻链3(LC3／Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切，成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰．与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶联，成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜,因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以估计自噬水平的高低。

图片来源：BMC Ophthalmol. 2018 Apr 27;18(1):110

2）细胞自噬底物蛋白的检测
p62偶联于LC3，作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬的中、晚期被降解。细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。蛋白质免疫印迹技术检测p62水平的降低可以反映自噬活性程度。p62的增加暗示着自噬、溶酶体降解途径被抑制。

图片来源：Front Physiol. 2018; 9: 441

3）Atg12-Atg5复合体 
除了LC3，自噬体膜上标志性蛋白质还有Atg12-Atg5结合体。Atg12和Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。

图片来源：Front Physiol. 2018; 9: 441

4）Beclin1 
哺乳动物Beclin1是酵母Atg6基因的同源物。Beclin1通过激活自噬对细胞生长和抑瘤机制进行控制。蛋白质印迹技术检测Beclin1蛋白表达情况直接反映自噬活性。

图片来源：Onco Targets Ther. 2018 Apr 9;11:2017-2028

5）自噬相关的标志性蛋白还包括ATG1、ATG9、DRAM1、ATG14、ATG16以及 ATG18等。


（五）自噬的调控通路
1）依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬 
A．PI3K-AKT-mTOR信号通路 

图片来源：Onco Targets Ther. 2018 Apr 9;11:2017-2028

B. AMPK-TSC 1/2-mTOR 信号通路 

2)其它的信号通路
A. 3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬。 
B. beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成ClassⅢPI3 复合物调控自噬。 
C. GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。 
D. 死亡相关蛋白激酶（death-associated proteinlinase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。

参考文献：
1.Li et al.Autophagy attenuates the oxidative stress-induced apoptosis of Mc3T3-E1 osteoblasts. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017 Dec;21(24):5548-5556.
2.Fu et al. Hyperoside induces both autophagy and apoptosis in non-small cell lung cancer cells in vitro. Acta Pharmacol Sin. 2016 Apr; 37(4): 505–518.
3.Yao et al. Crocin induces autophagic apoptosis in hepatocellular carcinoma by inhibiting Akt/mTOR activity. Onco Targets Ther. 2018 Apr 9;11:2017-2028.
4. Li et al. Manipulation of autophagy: a novelly potential therapeutic strategy for retinal neovascularization. BMC Ophthalmol. 2018 Apr 27;18(1):110.
5. Huang et al. Severe Burn-Induced Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction Is Associated With Endoplasmic Reticulum Stress and Autophagy in Mice. Front Physiol. 2018; 9: 441
 

自噬整体解决方案信息由深圳市拓普生物科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于自噬整体解决方案报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途