敲除效率鉴定服务（T7E1 Assay）

 T7EⅠ试验介绍       T7EⅠ试验指用T7EⅠ(T7 Endonuclease Ⅰ，T7核酸内切酶I)切割编辑后的退火DNA，根据DNA的切割率计算编辑率。T7EⅠ试验是检测CRISPR/Cas9系统编辑率的金标准。
  T7EⅠ试验的原理       T7EⅠ识别并切割不完全配对DNA、十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA，或者以更慢的速度切割或切刻双链DNA。T7EⅠ切割错配碱基5′端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。
       PCR扩增包括sgRNA靶点的DNA序列。将PCR产物变性退火，则编辑过的单链DNA会与未编辑的单链DNA形成有错配的双链DNA，而T7EⅠ能够切割该有错配的双链DNA。

 T7EⅠ试验流程1、提取转基因细胞或组织的DNA。
2、PCR扩增包括sgRNA靶点的DNA序列。
3、通过切胶回收纯化PCR产物。
4、纯化的PCR产物变性退火。
5、用T7EⅠ切割变性退火后的PCR产物。
6、电泳检测PCR产物的切割结果。
7、用Image J软件分析切割率，根据公式100×（1-（1-fcut）1/2计算编辑率（fcut指切割率）。
8、纯化的PCR产物测序。

 T7EⅠ试验的结果示例

 

图1 T7EⅠ试验的电泳结果


  图2 敲除鉴定测序结果

 

 

T7EⅠ试验服务说明

 

1、客户提供转基因细胞或组织，敲除基因的名称和编号，sgRNA序列。
2、HYY提供检测T7EⅠ切割结果的电泳图、PCR产物测序结果和说明实验过程中所用的耗材、仪器设备和操作过程的实验报告一份。
3、实验周期1～2周。

 

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途