单细胞／绝对定量／ChIP／ ATAC／TCR／MeRIP

10X Genomics 单细胞测序

一、产品简介：
10x Genomics的Chromium Controller是基于微流控技术的单细胞文库制备系统，可以同时获 得3000-80000以上的单细胞，制备文库和Illumina平台兼容，通过测序实现对高通量单细胞数据 进行细胞群体的分类以及细胞群体间基因表达的差异分析。10x Genomics单细胞表达分析可应用 的细胞类型众多，如肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞、神经细胞、生殖细胞、胚胎细胞等。是研究肿瘤异质性，免疫细胞群体和胚胎发育的优秀方法。

二、实验流程：
 

1.文库制备

首先获得单细胞悬浮液，并对单细胞悬液进行活性检测，细胞活性>90%方可进行后续实验。 为保证后续细胞的捕获效率，要求细胞浓度控制在700-1200cell/ul范围内。文库制备过程中，包含 着连接有cell barcode和UMI(unique molecular identifier)的poly-T引物序列的Gel Bead和细胞被“油 滴”包裹，形成GEM（Gel Bead in Emulsion），细胞在这个反应体系中溶解，并完成反转录，形 成全长cDNA序列。接着破碎油滴并纯化后，cDNA文库进行PCR扩增，并连接测序引物。文库制备过程如下图所示：

 

2.上机测试

文库构建完成后，先使用Qubit3.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100 对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用StepOnePlus Real-Time PCR System 荧光定量PCR仪进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞10nM），以保证文库质量。

质量合格的文库用Illumina平台进行测序。测序策略为PE150。


三、信息分析流程
 

Illumina平台测序所得原始下机序列（Raw Reads），通过去低质量序列、去接头污染等过程 完成数据处理得到高质量的序列（Clean Reads），后续所有分析都是基于Clean Reads。

康测优达10x Genomics单细胞转录组测序信息分析流程主要分为三部分：测序数据质控、 CellRanger进行基因表达定量与细胞鉴定和基于鉴定的细胞进行下游的细胞分群与差异表达基因 分析。其中，测序数据质控包括过滤测序所得序列、评估测序数据质量以及计算序列长度分布等；CellRanger基因表达定量与细胞鉴定主要利用cell barcode和UMI信息对单细胞中基因表达量进 行分析，同时CellRanger也提供根据表达量对单细胞群体进行划分，寻找群体间差异表达基因的 分析。第三步分析是基于CellRanger的细胞鉴定和基因表达定量结果，对进行下游分析的细胞和 基因进一步筛选，用高质量的表达数据再次进行细胞分群和差异表达基因分析。信息分析技术路线如下：

由于10xGenomics官方软件CellRanger分析在进行PCA、t-SNE及细胞聚类分析时未对低质量的数据进行过滤（如表达的基因总数低的细胞，在极少数细胞中检测到表达的基因）。因此虚线 所示的分析内容，会使用第三方分析工具Seurat过滤掉表达量矩阵中低质量的数据结果后进行二 次分析。对Seurat分析得到的差异表达基因进行GO、KEGG和蛋白互作网络功能分析。


四、案例解读

1.疾病与细胞亚型相联系 （对囊肿纤维化疾病生物学的新认识）

样品: 气管组织的气道上皮细胞

单细胞文库: ~1,500 细胞文库

测序: NextSeq  500

Analysis: Cell Ranger, Seurat





Digital RNA-seq（绝对定量转录组测序）

绝对定量转录组测序在文库扩增之前为每一条逆转录的cDNA片段加上唯一的身份标签（Unique Identifier，UMI或UID），也称为数字标签。数字标签会伴随片段扩增、测序、分析的全过程。同一个片段经过PCR扩增出来的产物均带有相同的数字标签，测序完成后利用UMI追溯每一个片段的来源，将相同来源的片段（具有相同的序列和UMI）进行合并，就能准确去除PCR扩增重复，一比一准确还原样本扩增前的原始状态。在此过程中，PCR扩增和测序错误同样可以被纠正：扩增和测序的错误会使得相同UMI标签对应多个不同的序列，那么只需比较这些序列的相似性，即可纠正这些错误。


绝对定量转录组利用UMI技术排除PCR扩增偏好和错误影响，可对表达量作准确的定量分析，与qPCR检测结果高度一致。绝对定量转录组测序为您带来全新的体验。
 

建库起始量从1ug降低到100ng，更适合稀少珍贵的样本。

准确筛选差异表达基因，既不错选也不漏掉。

避免低丰度转录本丢失，构建可靠的共表达网络。

准确检测寄生菌或内生菌的转录表达情况。对于难以分离的寄生菌，测序数据中有大量的宿主基因的转录本，通常需加大测序深度才能检测到寄生菌的转录本，而加大测序深度无疑又增加错误的几率、导致准确度下降。UID技术可去重并纠错，排除加大测序深度造成的影响，并对寄生菌的转录组准确定量。

在分析cSNP位点时，由于UID技术具有纠错功能，可排除假阳性位点，准确锁定真实的cSNP位点。

UID技术的纠错功能同样帮助确定可变剪接位点、RNA编辑，有助于可变剪接、RNA编辑的准确分析。

                    建库方法                                               技术流程

 
       KC-DigitalRNA测序结果通过qPCR验证                                    建库起始量仅需100ng


       提高clean data中unique reads的比例                                       良好的样本重复性
    

 

低丰度转录本的检测

某菌（植物的寄生菌，无法与植物组织分离）的转录组测序，将植物、某菌的参考基因组进行混合，然后比对，继而提取仅比对到该菌参考基因组上的reads，占比2.53%，大部分read（比对到植物参考基因组）未比对到该菌参考基因组。



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ChIP-seq(免疫共沉淀结合高通量测序)

核酸-蛋白互作研究系列产品：ChIP测序、 RIP测序、 CLIP测序、 MeRIP测序

一、产品简介
ChIP-seq是将染色质免疫共沉淀与高通量测序相结合的技术，通过蛋白免疫相互作用，用抗体把和染色质相互作用的蛋白（如组蛋白、转录因子等）沉淀下来，捕捉到细胞内动态的、瞬时的蛋白质与DNA之间的相互作用，从而所获取与其相结合的DNA序列，确定各种转录影响因子以及非组蛋白染色体结合蛋白在染色质上的具体位置。可以一次性得到目的蛋白在整个基因组上的结合分布，得到目的蛋白精确的结合位点以及结合基序等信息，若同时辅以转录组测序，则可以得到目的蛋白对全细胞基因表达的调控模式，大幅提高对目的蛋白的功能认识。

作为国内核酸-蛋白互作研究服务的领跑者，公司已完成1000多项ChIP-seq、RIP-seq、CLIP-seq实验及测序分析服务，包括动物（人、小鼠、大鼠、羊、鸡、斑马鱼等）、植物（水稻、拟南芥、小麦、二穗短柄草、马铃薯、番茄、苹果等）、微生物（大肠杆菌、禾谷镰刀菌等）近50余种物种的CHIP-seq和RIP-seq，其中组蛋白ChIP-seq成功率接近100%，转录因子ChIP-seq成功率超过95%，RIP-seq、CLIP-seq成功率接近95%。

二、康测技术优势

优化的ChIP实验体系，ChIP建库起始量低至1~30ng DNA；

武汉康测科技专攻IP（ChIP、RIP、CLIP）的博硕团队，拥有十年丰富的项目经验积累；

为客户选择抗体提供辅助指导，并对抗体进行质检、效价分析，提供文章发表质量的IP报告；

特有的Peak calling技术；

提供个性化的分析报告，可根据客户需要提供关联分析、解析目的蛋白调控机制。

四、建库方法及技术流程

    

五、分析结果展示

A：IP质检结果（input：样品裂解液中目的蛋白检测结果，IP：抗体富集目的蛋白检测结果，IgG：IgG富集目的蛋白结检测果）；
B：Reads在基因上下游的分布，结合峰主要位于转录起始位点（TSS）上游区域（ChIP_1/2/3为3个生物学重复）；
C：Peak在基因组各功能区的分布；
D：Peak的Motif分析。

ATAC-seq（染色质开放性区域测序）

一、产品简介：

染色质分为常染色质和异染色质，而常染色质处于松散的开放状态，允许反式作用因子结合顺式调控元件，进而调控基因表达。ATAC-seq 利用tn5 酶切割并捕获染色质开放区域，结合高通量测序和生信分析，可以系统研究全基因组范围内染色质开放区域，是表观调控研究的新方向。

二、项目流程：
 

三、康测科技优势：
 

国内核酸-蛋白互作研究服务领跑者，由加州大学圣地亚哥分校（UCSD）、武汉大学、华中农业大学博士后组建的团队，成员已在Nature、Cell、Melecular Cell、Nat.Struct.Mol.Biol等知名期刊发表文章十余篇；

实验流程精简，交付周期更短，性价比更高；

技术重复性好；

全面的多组学关联分析。

四、部分结果展示：
 

五、ATAC-seq的应用
 

六、案例解析

ATAC-seq、ChIP-seq、 RNA-seq关联分析揭示转录因子FOXA1的临床意义
FOXA1是驱动型转录因子(pioneer TF)，其突变能引起一定类别的前列腺癌。 作者通过对3086例原发性和转移性前列腺癌组织样本的调查，发现FOXA1 基因在前列腺癌中存在不同类型的突变,并且通过细胞模型和动物模型证明这些FOXA1基因突变对前列腺癌的发生或转移有促进作用。最后作者通过ATAC-seq、ChIP-seq、 RNA-seq等 技术研究FOXA1不同突变类型的作用机制。发现FoxA1竞争性结合AR调控的基因，并且不同的突变类型造成的结合位点不同，引起的染色质开放区域也不同,导致相关基因表达具有突变特异性。

参考文献: Adams EJ et al., FOXA1 mutations alter pioneering activity, differentiation and prostate cancer phenotypes. Nature, 2019, 571(7765):408-412
具体文章解读可以关注康测科技微信公众号，点击"Nature: 如何选择具有临床意义的基因并揭示其功能”。

T细胞受体（TCR）测序/免疫组库测序

一、产品简介

T细胞受体库测序（T cell receptor repertoire sequencing，TCR-Seq）是以生物信息学（Bioinformatics）全面高速分析高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）检测靶向扩增后的T细胞抗原识别决定性表面分子，即T细胞受体（T cell receptor，TCR）多样性的检测技术，用以揭示机体在生理和病理状态下T细胞介导的细胞免疫应答（T cell-mediated immune response）状态改变。
T细胞介导的细胞免疫应答过程中，抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）摄取抗原（Ag）、消化形成抗原-MHC分子复合物，并呈递给T细胞。T细胞通过自身T细胞受体β链中V-D-J基因重排后的CDR3β参与抗原识别。

TCR的基因由可变区（V）、多变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成，形成互补决定区（complementarities determining region, CDR）和间隔的4个骨架区（framework region, FR），基因结构如下图所示。在T细胞发育过程中CDR1、2和FR区域相对保守，CDR3区由V、D和J 进行重排而形成具有功能的TCR编码基因（T细胞克隆），由于V（65~100种）、D（2种）、J（13种）基因片段本身具有多样性，此外，由于在重排的过程中，在VD及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性。这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性，以识别各种不同的抗原。
         

TCR-seq常用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有T细胞或特定T细胞激活介导的细胞免疫反应中TCR基因重排碱基序列，以及各序列的丰度，用于研究不同T细胞克隆的转录情况和相互间关系，从而揭示更深层次的T细胞功能特异性，继而解释免疫应答机制、免疫耐受原因，免疫调节形式等相关生命现象。
    TCR-seq的应用方向：
   （1）肿瘤免疫治疗后的监测和治疗指导；
   （2）抗感染免疫治疗效果和耐受性评估；
   （3）移植排斥反应中急性排斥反应的预测和干预指导；
   （4）自身免疫疾病的临床试验和科学研究；
   （5）感染性和神经可塑性疾病的生物标志物。
 

二、绝对定量免疫组库测序是分析TCR的有力手段

检测TCR的RNA序列。与DNA分析相比，可以更为全面和准确地获得某一状态下TCR的多样性信息。

基于5’RACE的方法。5’RACE相较于MPCR测序方法，可以检测到更多的V-J pairing的多样性，同时具有更低的偏好性和较高的准确性。

5’RACE法与UID技术相结合，通过UID标签去除PCR扩增重复、排除PCR偏好性影响，准确分析TCR克隆的丰度。

引入校准机制，准确分析TCR的多样性。TCR的高度多样性使得其对测序数据错误极为敏感，PCR和测序错误都可能被误认为序列的突变或重排，因此必须加入校准机制。UID技术可纠正PCR和测序错误，锁定真实序列。

使用PE250测序，完整覆盖TCR全长。CDR1和CDR2对MHC的亲和力起到重要作用，同时检测CDR1/2/3对研究TCR具有重要意义。

三、康测技术优势

康测科技专利RNA(靶向)建库技术，缩短建库时间的同时提高建库效率；

自主创新的UID技术帮助实现TCR表达量的绝对定量；

提供从样本处理、TCR扩增、建库测序到数据分析的一站式完善服务。

                  建库方法                                                技术流程

四、分析结果展示

MeRIP测序 | 核酸-蛋白互作研究

核酸-蛋白互作研究系列产品：ChIP测序、 RIP测序、 CLIP测序、 MeRIP测序

一、产品简介

m6A甲基化修饰在基因表达调控、mRNA剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。

甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序（Methylated RNA Immunoprecipitation with Next Generation Sequencing，MeRIP-Seq）是研究细胞内转录组表观修饰的最新技术。这项技术通过使用N6-甲基腺嘌呤抗体富集高甲基化的RNA片段，然后结合高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，从而比较不同细胞、组织、样本间的RNA甲基化修饰模式的差异，可帮助解决细胞分化、生物发育、疾病发生发展、热休克反应等生物学问题。

二、康测技术优势

对抗体进行严格质检、效价分析，提供文章发表质量的IP报告；

对MeRIP实验体系进行精心优化

特有的Peak calling技术

提供个性化分析报告，可根据客户需要提供关联分析、解析m6A调控机制

三、建库方法及技术流程

  

分析结果展示

A）reads在基因上的覆盖情况：在peak区域，IP的reads覆盖度高于input（没有使用抗体富集的对照），（横轴为基因位置，左边纵轴为覆盖度）；           
B）Peak在基因5'UTR、CDS、3'UTR区域的分布；
C）基于差异m6A基因和差异表达的mRNA的联合分析（绿色三角表示显著差异的m6A修饰基因，黄色圆圈表示显著差异表达的基因，橙色五角星表示同时显著差异m6A修饰和显著差异表达的基因）；
D）Peak的motif分析。

单细胞／绝对定量／ChIP／ ATAC／TCR／MeRIP信息由武汉康测科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于单细胞／绝对定量／ChIP／ ATAC／TCR／MeRIP报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途