表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术也即蛋白指纹图谱技术是近几年发展起来的实验室诊断新技术。近年来，该技术在差异表达蛋白质组学，蛋白质相互作用及疾病检测方面得到了广泛的应用，尤其适合多肽及低分子量蛋白质谱分析的研。

一、实验目标

以蛋白质芯片SELDI系统为载体，通过对目标疾病组及正常对照组之间进行鉴定，以期找到能够区分不同组别的差异峰，并通过对差异峰进行蛋白质鉴定，期望找到与目标疾病密切关联的基因/蛋白。

二、实验方案

2.1．样品准备

采集临床病人及正常人血清，并做好临床资料的收集。采样数量大于100例，一般情况下病人样品与正常人样本相等，也可以病人样品略多于正常人。

采集患者术前血和正常对照外周静脉血立即放入4℃冰箱，过夜后3000r/min离心15分钟，取血清，20ul一管分装后置于-80℃冰箱保存。

2.2. 芯片实验及进度

芯片采用伯乐公司的WCX2蛋白质芯片。分为三个阶段：

预实验阶段：对相关的实验条件进行摸索，确定最佳的实验参数，需花时2周左右；

正式实验阶段：对样品进行实验操作，得到质谱图，需花时4周左右；

数据分析阶段：对实验得出的原始质谱数据进行分析，分析项目包括原始数据的分布情况分析、差异峰的筛选、聚类分析、主成分分析（PCA）、疾病预测模型的构建及差异峰所对应的蛋白的生物信息学鉴定六个项目，以充分挖掘原始数据中有价值的信息。花时2周左右。

2.3. 蛋白质鉴定

对差异峰所对应的蛋白(预测）进行实验验证。采用的实验方法为Western鉴定。我们对差异蛋白进行精选，挑选两个蛋白进行western实验，实验中用到的蛋白质抗体由客户提供。另外，需要提出的是，由于实验具有一定有不确性定，所以我们不保证该实验结果的准确性。但如果一旦发现目标蛋白，这结果将是一篇很好的SCI论文。时间为1-2个月

三、实验步骤

SELDI蛋白质芯片实验包括四个步骤：

步骤一：芯片类型的选择

蛋白质芯片提供了多种色谱的功能，包括亲水、疏水、阳离子交换、阴离子交换以及金属亲和表面等。此外，通过共价偶联选定的蛋白质或者其他目标分子，可以对芯片表面实现预活化，从而设计出具有更高针对性、特异性的芯片。

步骤二：上样

血清、细胞或者组织的裂解液、尿、脑脊液，或者其他蛋白质匀浆液等复杂的生物学样品——包括那些含有高浓度盐离子和去垢剂的样品——都可以直接上样于SLEDI蛋白质芯片表面。样品通过手工加样或者自动上样仪进行点样。复杂蛋白质样品中的一个特定亚群将通过简单的化学作用或者蛋白质相互作用被芯片捕获。

步骤三：未结合成分的洗脱

孵育后，未结合的蛋白和其他成分从芯片表面洗脱掉。只有那些特异性结合的蛋白质才保留下来用于进一步的分析。这种选择性的洗脱进一步选取基于芯片特色的蛋白质集合。

步骤四：在SELDI蛋白质阅读机上进行分析

在洗脱步骤之后，点加上含有能量吸收分子（EAM）的有机溶液。EAMs对样品的离子化起关键作用。在蛋白质溶解到含有EAM的溶液之后，溶液挥发掉，在芯片表面形成蛋白质和EAMs的共结晶。

芯片在SELDI阅读机上进行分析，后者是一种时间飞行质谱。芯片阅读机内有一个氮源的激光器，导致离子化和解吸附过程的产生。激光能量诱导蛋白质离子化以及从晶体态到气态的转变。

一旦进入到气态，带电蛋白质分子在一个分离电压作用下迅速地运动，或称“飞行”。分离电压对样品中所有的分子具有相同的作用，使之表现出基于分子量差别的不同飞行时间。SELDI阅读机记录下这些飞行时间，换算成分子量。

四、数据分析方案

1、数据预处理

原始数据经相关软件处理，设置第一步S/N>5,第二步S/N>2，得到peak cluster数据。以此数据进行了后续的分析。

2、差异peak筛选

利用wilcoxon sum rank test统计检验，我们检验了每个peak在组份中中值的差异。

3、层次聚类

对所有表达差异峰（peak）进行聚类，确定差异峰及不同样品之间的互作关系，一般认为在聚类图上距离越近的样品或差异峰之间的关系越密切。

4、PCA分析（principal component analysis）

通过对有显著性差异的peak做PCA分析，将样品的特征量压缩，在低维度空间反映样品之间的关系。用score plot展示PCA分析结果.

5、疾病预测模型的构建

利用决策树，Bayesian network, ANN及SVM等机器学习语言对芯片结果进行预测模型的构建，将部分芯片数据拿来做预测模型，然后部分芯片数据作为测试数据集（独立样本）来验证模型的准确性。

目的在于利用实验数据来筛选出一批靶标基因，并以此构建模型，以进行早期诊断、疾病预测和预后分析。

6、差异峰关联蛋白鉴定

为了进一步的对其进行鉴定，需要找到这些差异峰(peak)对应的蛋白质或基因。为了解决这个问题，我们根据相关SCI文献的算法构建一个软件peak2gene，用于对实验中找到的差异峰所对应的蛋白进行生物信息学鉴定。以便于客户进一步的利用RT-PCR，western等实验方法对感兴趣的目标蛋白进行鉴定。

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