饱和脂肪——肝癌的潜在分子标志：利用高光谱受激拉曼散射显微技术发现人类肝癌中饱和脂肪的异常积聚

人类癌症中存在脂质代谢失调现象，传统观点认为不饱和脂质的积聚会有利于肿瘤细胞存活和增殖。但目前还没有成熟的分析工具能够以高分辨率对未加工人体组织中的代谢物进行识别及定量。来自华中科技大学的Shuai Yan等人使用分析性高光谱激发的拉曼散射显微术，对24名肝癌患者的正常组织和癌性肝组织中的脂质代谢物进行了原位绘谱。发现与传统观点正相反，癌性肝组织中积聚了大量的饱和脂肪，而癌性肝组织周围的正常组织中几乎没有发现这种聚集现象。使用质谱进一步分析发现，癌性肝脏中甘油三棕榈酸酯含量非常高。这表明饱和脂肪的异常积累很有可能是肝癌的代谢生物标志。该研究以“Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels AberrantAccumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer“为题发表在Analytical Chemistry。

 

研究背景
 

大多数癌症都会导致代谢活动改变和代谢物异常，尤其是大多数癌症。已有多项研究表明脂质去饱和作用的发生与不饱和脂质的积累有助于肿瘤细胞的存活和增殖。然而Rysman等人发现，与非脂源性肿瘤组织相比，脂源性肿瘤组织中的脂质饱和度增加，这种脂质饱和度的增加可保护癌细胞免受自由基和化疗药物的影响。由于无法对完整人体组织细胞内的脂质分子进行定量绘谱，我们还无法得知人类肝癌中脂质的储存或去饱和作用情况。目前常采用质谱进行定量生化分析，但质谱需要几百毫克的组织样本，还需要破碎匀浆处理以及后续复杂的分离过程，因此质谱无法用于完整组织的分子绘谱分析。无创的自发拉曼光谱技术（spontaneous Raman spectroscopy）是一种光学分析方法，具有很高的分析灵敏度，目前已应用于癌症诊断。但由于斯托克斯光子的自发散射效率低，导致自发拉曼技术的采集速度较慢。通过用锁相脉冲激光器增强受激辐射，开发出的相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS)和受激拉曼散射(stimulatedRaman scattering, SRS)使拉曼跃迁速率增加了至少七个数量级，实现了快速振动成像，推动了生物医学研究进展。单频CARS和SRS具有优异的灵敏度、成像速度和对比度，但缺乏足够的化学特异性，不能识别复杂环境中的各种类型的生物分子。为提高成像选择性，研究人员将快速单频SRS成像与共聚焦拉曼光谱分析相结合，并使用这种组合方法，在人前列腺癌组织中发现，脂滴中不饱和脂肪存在异常积聚现象。在最近的研究中，双色SRS显微技术还应用于术中组织病理学诊断和快速决策，成功确定了脑肿瘤边缘。但由于光谱重叠，区分多种类型的生物分子还需要更高的光谱分辨率。因此研究人员又开发出了多通路、高光谱的SRS以及宽频CARS显微技术，极大地扩展了相干拉曼技术的适用范围，使其真正可适用于化学选择性成像，并可直接用于检查未处理的病变组织。但在人类患者中，这些有效的光谱成像工具还没有得到广泛应用。

本文从24名肝细胞癌患者中收集了正常组织和癌性肝组织，并进行高光谱SRS成像，得到饱和脂肪、不饱和脂肪、蛋白质的拉曼图谱。观察分析发现与正常肝组织相比，癌性肝组织中饱和脂肪出现大量异常积聚。使用质谱技术进一步研究发现与正常组织相比，癌性肝组织中甘油三棕榈酸酯(饱和脂肪的一种典型形式)的积累显著增加。这些发现表明，饱和脂肪在肝癌的发展中起着关键作用，可能是肝癌诊断的潜在标志，打破了癌细胞依靠不饱和脂肪生存和增殖的传统观点。

 

结果与讨论
 

研究选取了甘油三棕榈酸酯（glyceryltripalmitate, TP）和甘油三油酸酯（glyceryl trioleate, TO），它们分别为细胞中饱和脂肪和不饱和脂肪的主要存在形式，使用牛血清白蛋白（BSA）模拟组织内蛋白（图1）。
 

图1 甘油三棕榈酸酯（TP）、甘油三油酸酯（TO）和BSA的高光谱SRS成像。（a）TP和TO的化学结构。（b）CH区的相应自发拉曼光谱。（c）高光谱SRS成像MCR重建后的TP、TO和BSA多色图像。（d）经MCR优化过的SRS光谱。

图1b为对应CH区域的自发拉曼光谱：在①2853 cm-1位置TP（深黄色）和TO（绿色）都出现CH2峰；在②2885 cm-1处只有含长直酰基链的TP出峰；④3007 cm-1位置为不饱和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1处出峰。虽然几种物质的化学结构之间的差异很细微，但通过不同的拉曼带可以明显区分。

研究人员对TP、TO和BSA组成的混合物模进行了高光谱SRS成像，使用多元曲线分辨率(multivariate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空间分布图(图1c)，并制作了优化的SRS光谱(图1d)。得到的SRS光谱保留了所有振动拉曼带的关键特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并与自发拉曼测量的相应光谱非常一致(图1b)。虽然自发拉曼光谱光谱分辨率更好，因为有高性能光栅且积分时间较长(约10秒)，但高光谱SRS特别适合对生物组织中化学物质进行快速绘图，能够通过其内在的化学振动，对复杂生物组织中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸进行识别并成像。

验证了概念可行性后，研究人员从24名肝癌患者中获得了癌性肝组织及其邻近正常组织的标本，用超光谱SRS显微和MCR进行分析检测，发现了三种含较为量显著的化学成分。
 

图2 癌性组织中饱和脂肪和不饱和脂肪的高光谱SRS成像。（a-b）饱和脂肪（黄色）、不饱和脂肪（绿色）、蛋白质（）。（c-e）MCR重建的浓度图。（f-g）图c和d中指定位置的SRS光谱，在2853cm^-1处标准化。

图2c-e为主要代谢成分的MCR重建浓度图，图2a为彩色重叠图像，能更好地理解它们的相对空间分布。可直接观察到有两种类型的脂肪(黄色和绿色)在癌性肝组织中有显著积累。图2c为第一种类型的脂质成分，它以不规则形状的块状和液滴形式存在，对应非常强的拉曼带并在2885 cm-1处出现峰值，展示出饱和脂肪特征(②)，同时在3007 cm-1 (④)处的去饱和作用曲线平坦，表明反射光谱中没有=CH振动。图2d为第二种脂质浓度图，光谱显示不饱和脂质特性，在3007 cm^-1处有明显的拉曼带，主要储存在细胞内的脂滴中。MCR算法分析出的第三种化学成分为蛋白质，光谱主要在CH3的2935 cm^-1处出峰(③品红色)，且蛋白质在饱和脂肪（图2c）之外的位置中分布更均匀(图2e)。

为了更好地理解成分变化，研究人员收集了图2c、d中五个不同位置的SRS光谱。发现在S1、S2和S3位置，饱和脂肪特点非常突出(图2f)。其微观形状更接近致密的圆形脂滴(图2c)。但S4和S5位置为饱和脂肪和不饱和脂肪的混合物。同时从形态学上看，其通常具有不规则的形状，在浓度图中作为大尺寸的脂质块存在。在图2d不饱和脂肪的MCR重建图像中还发现了不同位置的一定程度的光谱变化。在U1、U2和U3位置，展示出不饱和脂肪的特征(图2g)。SRS浓度图中，它们的大小较小，呈规则的圆形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白质可能在空间上与不饱和脂肪重叠。后续通过计算光谱差异验证了这一假设。因此可以认为这些是脂质和蛋白质的聚集体，它们也以不规则形状的斑块形式出现(图2d)。

从上述分析结果来看，癌性肝组织中有两种含量较多的脂质。在脂滴中存在大量的饱和脂肪，而且有些会与不饱和脂质混合在一起。而不饱和脂肪大多伴有细胞内蛋白质。

为从更大面积上证实癌性肝组织确实较正常肝组织储存了更多的饱和脂肪，研究人员对约500 × 500 μm²大小的癌性组织和正常组织进行了高光谱SRS成像研究。



图3 癌性肝组织及其周围正常肝组织的高光谱SRS成像。（a-b）25号患者癌性组织和正常组织的图像。黄色为饱和脂肪，绿色为不饱和脂肪，品红色为蛋白质。

图3a为16幅高光谱SRS图像及其MCR重建图像结合生成的大比例尺浓度图。分析发现在癌组织中饱和脂肪(黄色)广泛分布，但邻近的正常肝组织中，饱和脂肪较少(图3b)。而且正常组织中的肝细胞组织良好，细胞形态清晰。

最后研究人员检测了24名患者的组织样本，每个样本随机选择1-3个不同的位置进行SRS成像并通过MCR重建图像中饱和脂肪的面积进行定量。

 

图4 利用高光谱SRS成像和质谱对饱和脂质进行定量。（a）高光谱SRS对24名患者的正常组织和癌性组织成像图。（b）质谱检测11名患者正常和癌性肝组织抽提的脂质中TP、TO和TL含量。

图4a为每个样本观察区域的饱和脂肪统计量。可见癌性肝组织中，饱和脂肪的平均面积分数约为12.21%，其中有两例患者面积分数甚至高达约40%，而在正常肝组织中仅约0.17%，即大多数正常组织检查部位中没有观察到饱和脂肪积聚。随后研究人员使用质谱仪定量分析了11名患者的癌性肝组织和正常肝组织(图4b)，测量了包括甘油三棕榈酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在内的脂质含量。发现癌性肝组织中的TP含量确实约为正常组织的6倍，正常肝组织中不饱和脂质包括TO和TL的水平也较高。同时在一些患者的正常肝组织中，也观察到了含有不饱和脂肪的大尺寸脂滴。因为在癌组织和正常肝组织中都观察到不饱和脂肪，所以不饱和脂肪可能并不是癌组织所特有的。而经高光谱SRS成像和大量数据分析都发现，癌性肝组织中的饱和脂肪含量明显高于正常组织，这表明饱和脂肪很有可能是肝癌代谢生物标志物。

 

研究小结
 

不同的癌症类型对代谢途径的影响各有不同，储存代谢物方面也存在区别。利用SRS检测生物分子固有振动信号这一特性，研究人员已经能够在完整人体组织中原位识别出异常代谢积累的分子。之前由于缺乏有效的工具，对肝癌脂肪饱和度的研究很少。而本研究发现癌性肝组织的脂滴和聚集的脂质块中储存的饱和脂肪明显高于其邻近的正常组织，超越了传统对于肝癌分子标志的理解。因此利用这种化学分析和高分辨率成像的方法，可以在分子水平上容易地确定癌性病变中的代谢物变化，这有望为癌症诊断和预后相关的临床应用提供新的见解。

参考文献：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
 

高光谱显微系统
 

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