定量OCTA揭示清醒与麻醉小鼠脑皮层的血管和血流差异

大多数体内神经血管成像研究都是在麻醉动物中进行的，但麻醉对脑血液动力学有很大影响。因此华盛顿大学研究人员Adiya Rakymzhan等应用光学微血管造影（OMAG）和多普勒光学微血管造影（DOMAG），定量评估了麻醉对小鼠脑血管系统和脑血流量的影响。OMAG结果显示麻醉剂ketamine-xylazine和异氟醚（isoflurane）会引起大血管直径和毛细血管密度增加，表明两种麻醉剂会都引起血管舒张。此外DOMAG的初步结果显示异氟醚会使基线脑血流量增加。证明通过OCT血管造影方法，能够测量清醒与麻醉小鼠间大血管和毛细脑血管网络基线形态学和血流参数的差异。文章以“Differences in cerebral blood vasculature and flow in awake andanesthetized mouse cortex revealed by quantitative optical coherence tomographyangiography”为题发表于Journal of Neuroscience Methods。


背景
使用活体动物模型成像脑血流（CBF）对于理解CBF调节和脑功能的机制来讲意义非凡。由于在图像采集过程中，要避免因运动产生的伪影，因此大部分光学成像研究都是在麻醉动物中进行。然而不同的麻醉剂会破坏基线（刺激前的静息）血液动力学和对刺激的功能性反应，可能导致对血液动力学反应和脑血管疾病研究的实验结果出现不同解释。如使用α-氯醛糖（α-chloralose）或乌拉坦（urethane）麻醉时，脑血管对乙醇的反应为血管收缩，而氟烷（halothane）麻醉时乙醇诱导血管舒张。因此非常有必要研究麻醉对动物模型基线脑血液动力学的影响。此外有研究表明，上游动脉和皮质内微血管可能具有单独或独立的机制来调节局部CBF，表明有必要从大血管和微循环（毛细血管）两者水平上研究血管反应。

有研究报告了麻醉动物和清醒动物对功能性刺激的血液动力学反应的差异。小鼠视觉皮层的光学成像结果显示，与麻醉期情况下相比，清醒时神经活动后的血液动力学反应更强、更快。对大鼠的功能磁共振成像（fMRI）研究表明，乌拉坦麻醉后，胡须刺激引发的血液动力学反应的时间分布与清醒状态不同。使用正电子发射断层扫描（PET）对狒狒的研究中发现，由于ketamine麻醉对枕叶的影响，静息CBF增加，但受限于空间分辨率，没有探索血管形态变化。双光子成像量化了异氟醚（isoflurane）麻醉对狨猴脑微血管的舒张作用，并显示基线血流速度降低。然而受限于视野（FOV），仅在单个血管层面进行了分析。有研究使定量光声显微镜评估了异氟醚麻醉下，小鼠脑的基线血液动力学和氧代谢的变化，但研究集中于大血管，并不包括毛细血管反应评估。鉴于基础血液动力学参数定量信息的缺乏，以及当前成像模式的技术限制，需要对宏观和微血管水平的麻醉效果进行更详细的分析。

本文使用光学相干断层扫描（OCT）探究了麻醉剂对基线状态血管尺寸和CBF参数的影响。光学显微血管造影术（OMAG）是OCT的一个高级扩展，其优势在于可以几乎不受背景组织噪声影响地提取血流信号，基于此发展出了另一种OCT血管造影方法，即Doppler OMAG（DOMAG）。DOMAG可检测穿透血管中的轴向血流速度，这会揭示关于脑血流的详细信息。OMAG和DOMAG技术的结合已广泛用于各种脑血管研究，包括卒中、动脉新生和衰老。本研究的主要目的是证明该OCT双图像处理方法能够补充且更全面地分析麻醉对脑血管形态和血流的影响。

本研究应用OMAG和DOMAG相结合的方法比较麻醉和清醒状态下，小鼠皮层的血管和血流参数。通过测量动/静脉直径、毛细血管面积密度、毛细血管流量、轴向流速和总血流量的变化，系统评价异氟醚和ketamine-赛拉嗪对脑血管张力和血液动力学的影响。

 图1 OCT系统示意图。

结果
01-麻醉对血管舒张的影响
 

OMAG揭示了异氟醚和ketamine-赛拉嗪（K-X）诱导的血管扩张（图2）。为使比较更准确，根据分支顺序对静脉和动脉分支进行分类：1段（Seg1）为最近端，2段（Seg2）在中间，3段（Seg3）为最远端（图2A）。图2B和C分别为OCT获得的皮层结构和血流横截面图像。从图2C黄色和蓝色线间约50μm厚的组织数据获得OMAG血管造影图像。图2D-F的血管造影图对应异氟醚麻醉、K-X麻醉和清醒状态。从图2G-I二元掩模（binary masks）图像中测量Seg 1（红色）、2（绿色）和3（紫色）的静脉和动脉直径值。比较三种不同方案中每个静脉和动脉段的ΔD（图2K-L）。总的来说，从清醒到异氟醚麻醉状态呈增加趋势。K-X麻醉组静脉Seg 3的ΔD比清醒组高11 %（p = 0.0498）。异氟醚组静脉Seg 2的ΔD比K-X组高6%（p = 0.0430），比清醒组高22%（p = 0.0198）。异氟醚组动脉Seg 1的ΔD比K-X组高12 %（p = 0.0352），比清醒组高29%（p = 0.0104）。这些结果表明，与清醒状态相比，麻醉状态下的静脉和动脉直径增加，意味着异氟醚和K-X会引起显著的血管扩张。

 

图2动静脉段直径的比较。（A）血管分支的分类。（B）B-scan结构截面图像。（C）B-scan血流截面图像。黄线表示皮质表面，蓝线和绿线分别位于距皮质表面50μm和300μm深度。（D-F）不同状态下OMAG血管造影照片，从3D OMAG数据集的正面MIP获得，位于图C黄色和蓝色虚线之间。（G-I）分别对应D-F血管造影的血管掩膜图像，用紫色（Seg3）、绿色（Seg2）和红色（Seg1）表示血管直径大小。（K-L）三种状态下Seg 3、Seg 2和Seg 1静脉和动脉直径变化指数的比较。
 

02-毛细血管的血管面积密度和流量
 

比较三种不同状态下的毛细血管的VAD（vessel area density）和流量，处理OMAG血管造影（图3A–C）结果，排除大动脉和大静脉（图3D–F）。生成其余毛细血管在异氟醚、K-X麻醉和清醒状态下的毛细血管VAD图（图3G-I）和流量图（图3K-M）。图3N显示了三种不同状态下的流量指数分布符合核分布（Kernel distribution），其中观察到异氟醚组的流量指数最大，超过平均值，而清醒组的流量指数最小。图3O-P分别给出了三种条件下给定区域的平均VAD和平均CFI（capillary flux index）的比较。结果显示，清醒组的平均VAD比K-X组低23%（p = 0.0368），比异氟醚组低25%（p = 0.0065）。清醒组的平均CFI比K-X组低5%（p = 0.0369），比异氟醚组低15%（p = 0.0131）。总的来说，从清醒到麻醉状态，毛细血管VAD和平均CFI都增加了。
 

图3毛细血管中VAD和流量的比较。（A-C）三种状态下的OMAG血管造影，彩条代表信号强度高低。（D-F）不包括动脉和静脉的OMAG血管造影。（G-I）三种状态下的毛细管VAD图。彩条代表局部白色像素比例，其中蓝色较小，红色较大。（K-M）三种状态下的CFI图。颜色条表示从0到1的强度信号。（N）三种状态下的毛细血管通量直方图分布符合核分布。（O）三种状态下的平均VAD比较。（P）三种状态下的平均CFI比较。

03-穿透血管的脑血流测量
 

为评估清醒状态和麻醉状态之间的脑血流差异，量化了一只动物的红细胞轴向速度、血流横截面积和总血流（图4）。图4A和B显示了异氟醚麻醉和清醒状态下的双向正面DOMAG轴向速度图谱。分别以绿色和红色显示下潜的小动脉和上行的小静脉，以6.0mm/s范围的彩色条编码表示轴向流速信息。从图4C 3D数据提取矩形切片（图4D-E），以比较清醒组和异氟醚组间四个区域的平均轴向速度（图4F）、流动横截面积（图4G）和总血流（图4H）。从清醒到异氟醚麻醉状态，平均流速值仅增加3%，而血流横截面积值增加57%（p < 0.04），总血流量增加55%（p < 0.04）。此外从图4A，B，D和E发现，从清醒状态到异氟醚麻醉状态，穿透血管密度增加，这支持了图3G-1中毛细血管VAD结果。



 

图4一只种动物脑血流参数的比较。（A-B）异氟醚和清醒状态下小鼠皮层的双向轴向脑血流速度图。颜色条表示红细胞在6.0mm/s范围内向下（负，绿色）和向上（正，红色）移动的轴向速度。黄色是投影效果产生的绿色和红色信号的混合。（C）从3D DOMAG数据集生成的300μm厚组织的3D可视化图像，带有上升和下潜的血管。（D-E）C中皮质表面以下约50mm x-y平面上的矩形切片。绿点和红点代表血管流动横截面。（F-H）平均轴向速度、血流横截面积和总血流量的比较。

结论

 

本研究使用OMAG和DOMAG技术，从大血管和毛细血管水平定量比较了清醒与麻醉状态下的脑血管舒张和血流情况。发现麻醉剂会使血管直径增加，异氟醚增加最大，ketamine-赛拉嗪程度较轻，进一步支持麻醉引起大血管扩张。

本研究中的OMAG技术也证明可在毛细血管水平上显示血管灌注和扩张增加。VAD描述了整体毛细血管灌注，也反映了血管大小的变化，给出了关于毛细血管扩张的信息。从清醒状态到麻醉状态，平均VAD增加（图3O），表明毛细血管灌注和毛细血管扩张增加。此外，从清醒状态到麻醉状态，平均CFI增加（图3P），意味着麻醉也提高了毛细血管流量。

已知大脑血管扩张导致动脉压降低，随后会引起CBF升高和外周血灌注。在一只动物身上进行的对比实验发现，虽然红细胞的平均轴向速度从清醒状态到异氟醚状态没有显著变化（图4F），但流动横截面积增加了57 %（图4G）。总血流量也增加了55 %（图4H）。与已有的结论一致，即异氟醚和ketamine会使基线CBF增加。

此外尽管成像技术发展迅速，但向完全清醒成像仍有一定难度，动物产生的压力和不适会影响获得的信号。已知麻醉剂的作用是剂量依赖性的，低异氟醚浓度（1.3%-1.5%）可保持CBF值与清醒状态接近。因此可以在不同条件下进行实验，并将获得的结果进行比较，以产生可靠的结果。

总之，本研究使用OMAG和DOMAG技术，测量并比较了清醒与麻醉小鼠大脑血管和毛细血管网的基线形态学和血流参数。结果显示异氟醚和ketamine-赛拉嗪会引起大血管和毛细血管舒张。血管尺寸的增加导致CBF增加。证明了OCT双图像处理方法可以补充并全面分析麻醉对脑血管和血流的影响。

参考文献：Rakymzhan, A. , et al. "Differences in cerebral blood vasculature and flow in awake and anesthetized mouse cortex revealed by quantitative optical coherence tomography angiography." Journal of Neuroscience Methods 353.2(2021):109094.