Opt. Lett.：液体变焦镜头结合OCTA进行小鼠大脑深层皮质血流成像

华盛顿大学研究人员YuanDong Li等在1.3μm谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）系统中，结合使用液体变焦镜头（也称electrically tunable lens, ETL），突破了传统OCT系统在小鼠大脑皮质OCT血管造影（OCTA）中的焦深限制。液体变焦镜头能够快速并动态地控制探针光束沿小鼠整个皮质的轴向聚焦，在此基础上，通过将六个焦深的OCTA图像拼接到一起，实现了对皮质各层的脑血流成像。成像结果揭示了各皮质层的毛细血管系统和轴向血流速度，并首次揭示了脑白质中的毛细血管系统和轴向血流速度。因此该集成系统有助于研究小鼠大脑深层皮质中的血流动力学。同时液体变焦镜头的紧凑集成，对未来手持式或腔内OCT探头的设计也有很大启发作用。研究成果以“Electrically tunable lens integrated with optical coherence tomographyangiography for cerebral blood flow imaging in deep cortical layers in mice”为题发表于《Optics Letters》。


背景

大脑皮质沿轴线可分为六个生理层，以细胞类型和密度区分。如小鼠大脑中，主要的传出锥体神经元大部分位于皮质的第三和第五层。神经生理差异是的这些皮质层在功能活动期间的代谢需求不同，而功能行活动受血流的空间和时间调节支持。使用功能磁共振成像的研究显示了猫在视觉刺激期间，大脑皮质中部的最大血流量变化，但成像分辨率不足以确定峰值血流量变化的确切位置。其他研究使用团注追踪观察大鼠体感皮质激活期间，第四层中最早和最大量的红细胞到达，但仅捕获了几个小动脉来估计时间信号的变化。到目前为止，还没有实现对特定皮质层，特别是深层皮质的毛细血管系统和血流动力学的直接成像，这阻碍了对神经血管耦合和皮质功能的系统研究。

光学相干断层扫描血管造影术（OCTA）是一种新兴的神经血管研究工具，可对啮齿动物血流进行高分辨率的三维血流成像以及速度绘图，并且视野大（几厘米）、不需要造影剂。OCTA的扩展，毛细血管测速法，揭示了在感觉刺激期间，激活的小鼠皮质中的毛细血管流均匀化及其对脑氧合的贡献。在衰老和阿尔茨海默病研究中，毛细血管测速法还帮助探究了与病理相关的毛细血管通过时间不均匀性变化。

然而这些研究只能量化皮质表面下300μm浅深度内的动态信号，仅到达小鼠皮质的第三层。原因在于使用高斯光学（Gaussian optics）将OCT光束传送到皮质组织中，其中聚焦深度（DOF）（∼λ∕NA2）与横向分辨率（∼λ∕2NA）是互相关联的。使用高数值孔径和锐聚焦时，只选择了达到系统所需横向分辨率的一小部分深度范围（以OCT光束的瑞利长度区分）用于毛细血管血流定量。

在不牺牲横向分辨率的情况下，扩展DOF的一个有用且实用的解决方案是沿着成像对象的深度移动探测光束的轴向焦点。但在脑血流成像中，该方法很难精确定位皮质层平面，无法快速有效地捕获神经-血管耦合期间多个大脑层中的血液动力学响应。因此轴向移动扫描光学器件或平移成像平台不可行。

本研究创新性地将液体变焦镜头与SD-OCT系统结合，对小鼠皮质脑血流进行了多焦平面成像（图1）。集成系统包括一个宽带超发光二极管（SLD）光源，中心波长1340nm，带宽110nm（-3dB）。该光源的轴向分辨率在空气中约7.5μm（小鼠脑组织中约5.1μm）。干涉仪的输出光导入一个自制光谱仪中，其光谱分辨率约0.141nm，可检测深度范围约3mm。光谱仪使用的线阵相机（1024像素检测器阵列，Goodrich Inc.）线扫描速率为92kHz。系统灵敏度在焦点处为105dB（零延迟以下约500μm），样品处的入射光功率约5mW。样品臂扫描振镜前放置一个液体变焦镜头（EL-10-30 series, Optotune Inc.）和一个10倍物镜，有效焦距18mm，用于将OCT光束聚焦到皮质，获得的横向分辨率约11μm，DOF约200μm。液体变焦镜头配备-1.5到＋3.5屈光度（dpt）的调谐范围和一个偏置发散透镜（f = -150mm）。

图1 液体变焦镜头的定制SD-OCT系统示意图。SLD，超发光二极管；PC，偏光镜控制器；ETL，液体变焦镜头。插图为一个镜头调整周期内，小鼠皮质的多聚焦平面成像方案。CTX，大脑皮质；HP，海马体。

结果
 

首先测量集成系统焦点调整性，通过安装在线性平移台上的光束轮廓仪测量焦点位移，将聚焦功率设置为＋0.5和＋1.4 dpt进行两次测量。绘制出最大强度（光束中心）相对于沿光束距离的图像（图2a）。两条曲线表明光束的焦点有685 μm的偏移。因此本研究使用的＋0.5到＋2.0 dpt范围对应约800μm的焦点调整范围。加上物镜的约200μm DOF，一个液体变焦镜头系统将能够覆盖小鼠皮质的1mm深度。OCT M-scan测量液体变焦镜头的时间响应性，同时在OCT光束焦点处放置一个反射镜，并向液体变焦镜头发送步进驱动信号，从＋0.5到＋1.4 dpt调整。来自反射镜的OCT信号的位置用于表示焦度（图2b）。测得调节时间为5.46 ms，动态性能足以用于快速焦点调整，以满足在神经血管耦合研究中的要求。


 

 图2（a）在＋0.5和＋1.4 dpt焦度下测得的光束强度分布图，显示焦点位移。（b）当焦点功率从＋0.5到＋1.4 dpt时液体变焦镜头的阶梯响应。
 

选择三个月大的雄性C57BL/6小鼠（n=3），进行皮质脑血流的体内扩展DOF成像。用异氟醚麻醉动物，制作5 × 5 mm颅骨窗口以消除颅骨组织散射对脑成像结果的影响。在不同轴向位置连续进行OMAG和DOMAG（Doppler OMAG）。OMAG协议中，每个B-scan含400个A-line扫描，在x轴可达约2.5mm，血管造影需要重复8次B-scan，垂直方向采集400个，y轴可达约2.5 mm。因此一个处理过的三维血管造影照片的数据立方体由1024×400×400（z-x-y）体素组成。DOMAG协议中，每个深度位置采集25个A-line扫描产生一个M-scan（z轴）。一个B-frame有380个M-scan，x轴上约2.5mm，每个3D数据集有300个B-frame。因此一个DOMAG数据立方体由1024×380×300（z-x-y）体素组成。为描绘-6.1 mm∕s的轴向速度范围，以3条A-line间隔对复合信号进行多普勒处理，以增加有效A-line之间的Δt。使用相位方差掩模从噪声相位背景中分割出有意义的多普勒血流信号。

图3a-f为一个调整周期内的6幅OCT结构B-scan图像，显示了信号强度沿皮质深度的动态变化。液体变焦镜头以0.3 dpt间隔从＋0.5到＋2.0 dpt调整，因此焦平面从图3a到3f依次下移。焦平面位置周围的组织（黄色虚线）反射/散射的光更多，是该区域的激光功率密度更高所致。从B-scan图像中提取的A-line强度分布图（图3h）也证明了这一点，当聚焦平面移动得更深时，更深处皮质组织的强度显著增加。图像采集后进行焦点叠加，简而言之，B-scan图像用一组高斯窗口（图3a-f白色曲线）掩模，以对失焦区域进行加权，然后求和生成图3g中的合成图像。合成图像的轴向强度分布（图3i）显示，沿皮质深度的OCT信号强度足够，在软脑膜和脑白质处有两个主要峰值。

 

图3不同焦点下小鼠大脑皮质的OCT B-scan描结构图像。（a–f）从软脑膜到白质（皮质表面下0-1000nm）六个不同焦平面获得的图像。黄色虚线表示焦平面中心，白色虚线方块为DOF区域。应用高斯窗口（白色曲线）过滤出失焦区域并融合生成（g）。（h）归一化的轴向强度分布。（i）g中合成图像的轴向强度分布图，在软脑膜和白质处发现两个强散射峰。

为验证对整个小鼠皮质中毛细血管流动成像的横向分辨率，比较了一个调整周期中的OMAG B-scan（图4a-f）和3D正面投影（图4g-l）。受限于成像物镜的DOF（约200μm），DOF以外的区域严重模糊，血管在视觉上变大、无法分辨。用单焦平面模式不可能同时获得软脑膜和深层皮质（和白质）血流。通过使用高斯窗口的聚焦体积叠加，能够生成融合的3D体积。与单个体积相比，多焦平面成像可同时分辨所有皮质深度的毛细血管流动。3D正面图像（图4g-l）中也可以看到脑白质深度的详细的血管特征（图4l）。这些结果表明液体变焦镜头可以有效扩展OCTA的DOF，同时保持深度皮质血流成像的最佳横向分辨率。


 

图4不同焦平面的OMAG图像。（a–f）从软脑膜到脑白质六个不同焦平面获得的B-scan血流图像。虚线方块为200μm DOF区域，用于制作正面最大强度投影（MIP）图像，即（g）-（l）。黄色虚线表示B-scan的位置。
 

为了显示聚焦体积叠加方法获得的血流图的连续性，展示了融合3D体积中的5个连续OMAG截面（图5a-e），显示了整个皮质深度上的扩展DOF的血流信号。5张图像显示了跨越六个拼接体积、垂直连接良好的血流信号，黄色方块处甚至可见连续的穿透血管。

图5从多焦平面融合血流体积中选择的OMAG截面。（a–e）分别对应编号282-286的B-frame。黄色方块为连续的穿透血管。

最后根据组织学，用小鼠S1皮质的横截面组织厚度校准了成像的轴向深度，并根据六个皮质层和脑白质的轴向位置生成了OMAG和DOMAG正面图像（图6a-f）。OMAG用于绘制血管灌注图，DOMAG用于检测血管中红细胞运动的轴向速度。在高分辨率血液灌注图和双向轴向速度图中，有些血流信号（青色框）仅在特定皮质层中被识别（图6d–f）。图6f清楚地显示了脑白质血液供应及其相应轴向速度（青色箭头）。

图6不同皮质层和脑白质的OMAG和DOMAG图像。每个图像都是由DOF区域的正面MIP投影生成。彩色条表示血流的红细胞轴向速度，以±6.1 mm∕s范围速度向脑深部下行（绿色）或从脑深部上行（红色）。青色框和箭头表示在特定层中检测到的独特血流。

结论

本研究创新地将ETL集成到OCTA中进行多焦平面的大脑皮质血流成像，通过聚焦体积叠加，成功显示了从软脑膜层到脑白质的连续血管图。证明了在大脑皮质深处的脑血流成像中，在OCT/OCTA系统中使用ETL可成功扩展DOF。将该系统应用于小鼠深层皮质功能性血流成像，可便于研究目标皮质层位置的血流动力学。此外，ETL集成的紧凑性使得它很有潜力结合到手持或腔内OCT探头中，对研究和临床应用都会有巨大帮助。

本研究使用的液体变焦镜头也存在一定局限性，如不考虑快速响应和调节时间（5.46ms），OMAG和DOMAG每个3D数据集在每个焦平面的数据采集时间分别为15s和50s，六个焦平面可能需要几分钟，但通常无法保证这段时间内神经状况和血液动力学状态的稳定。因此该方法更适合于评估感兴趣的单个皮质层的血流动力学，如大脑功能激活期间最活跃的第四层中的血管通过时间和不均匀性。此外通过利用高速扫频源，还可以进一步提高系统速度。未来可能在几分之一秒内用动态聚焦进行体积血管造影术。

参考文献：Li, Y. , et al. "Electrically tunable lens integrated with optical coherence tomography angiography for cerebral blood flow imaging in deep cortical layers in mice." Optics Letters 44.20(2019):5037.