Small：利用近红外二区发光的纳米点（Nanodots）对急性心肌梗塞进行体内瞬时成像

急性梗塞发生后，作为实现准确和有效治疗的第一步，临床医生需要快速且精确定位心肌缺血组织。现今早期心脏病发作的诊断基于生化血液分析（检测心肌酶）或超声波辅助成像，耗时且空间分辨率低。克服这些经典技术局限性的新技术也就应运而生，如纳米技术。由此西班牙和中国研究人员S. Mateos等利用生物功能化的近红外发光纳米粒子，对急性心肌梗塞后的心脏进行了体内成像。利用近红外荧光成像的优越采集速度和纳米粒子的高效选择靶向性，在急性梗塞事件后仅几分钟就可获得梗塞心脏的体内图像。为急性梗塞后缺血心肌的高效、快速和准确的体内成像开辟了一条途径。研究成果以“Instantaneous In Vivo Imaging of Acute Myocardial Infarct by NIR-IILuminescent Nanodots”为题发表于Small。

背景

心血管疾病（CVD）严重威胁人类健康，且影响越来越大，使得提高CVD诊断能力变得尤为关键。在心血管事件（如梗塞）早期，如果诊断及时，会大大提高康复治疗的效果。此外早期诊为减轻事件对患者的影响提供了更多时间，减轻了医疗系统的负担。特别是急性心肌梗塞（心脏病发作）中，冠状动脉闭塞事件引发心肌缺血和缺氧，通常导致不可修复的损伤和/或死亡，因此早期诊断、评估和治疗显得尤为重要。目前临床对心肌梗塞的成像和诊断的依赖超声成像（分辨率低）、生化血液分析（相对较慢）、磁共振成像（昂贵耗时）以及核医学如x光血管造影、断层摄影技术（昂贵且有害）。因此仍亟需开发新的成像技术，能够在急性梗塞后对心脏进行低成本、快速和无电离辐射的可视化及诊断。

随着材料合成和修饰的进步，促成了基于使用纳米粒子作造影剂的新诊断技术和疗法。如基于磁性纳米粒子、脂质体和多孔硅（PSi）纳米粒子的梗塞心脏成像。但它们或者无法进行体内成像，或者需要昂贵的仪器。发光纳米粒子（LNP）可以克服这些限制（表1）。但800nm以下荧光成像的固有局限性（如穿透深度差、与自发荧光的不良重叠）限制了这些纳米粒子的临床应用。此外使用LNP只能在梗塞后几小时/几天对梗塞心脏进行体内成像，仍无法实现快速（几分钟）体内诊断。

近红外二区（NIR-II）发光的LNP可解决800nm以下荧光成像的局限性问题。在NIR-II光谱覆盖的1000nm-1700nm内，组织会随着消光系数最小化而变得部分透明。此外NIR-II荧光成像可减少背景自发荧光和组织引发的散射。通过使用稀土掺杂的纳米粒子、碳基纳米粒子、半导体有机聚合物和纳米粒子或半导体量子点（QDs），NIR-II体内荧光成像能力得到了验证。其中Ag₂S纳米点（nanodots, NDs）由于合成方便、亮度好、毒性小、生物相容性好而广受关注，并已成功用于体内癌症、血管成像、生物分布研究、光热治疗、非接触式热感应、放射诊断和心血管系统成像。其中一些应用对Ag₂S NDs进行表面修饰，使其与肿瘤等目标组织具有亲和力。已知心肌事件期间，血管紧张素-肾素系统的血管紧张素受体1（AT1R）在心肌中过表达，为实现选择性靶向缺血心肌组织提供了可能。AT1R的天然配体是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），Dvir等人通过将纳米尺寸的PEG化脂质体连接到AngⅡ并搭载有机染料DyLight649，在梗塞后24h获得了小鼠梗塞心脏的离体荧光图像。AngⅡ-Ag₂S NDs也成功用于NIR-Ⅱ荧光成像离体Langendorff模型的心肌梗塞，证明AngⅡ的功能修饰有望实现心脏病发作的快速成像。但离体情况下的有效靶向性不代表其在体内同样具有适用性。当进行全身静脉注射的体内实验时，蛋白冠的形成也会影响AngII-Ag₂S NDs的靶向能力。此外梗塞心肌组织的有效积聚还需要其他器官（如肝脏和肾脏）对AngII-Ag2SNDs的保留或清除作用最小化。

本研究使用AngII-Ag2S NDs在心肌梗塞后的短时间（几分钟）内对心脏进行NIR-Ⅱ体内成像。进一步时程分析评估静脉注射后缺血心肌组织中AngⅡ-Ag₂S NDs的选择性积累速度。比较AngII-和PEG-功能化的Ag₂S NDs的生物分布模式，评估了AngII-Ag2S NDs的选择性。

结果

图1a为研究方法示意。结扎小鼠的冠状动脉左前降支（LAD）30min诱导心肌梗塞，然后再灌注30min，引发受影响心肌组织中AT1R受体显著过表达（图1a）。再灌注后立即静脉注射AngII-Ag₂S NDs（100μL，1.5mg mL^-1，眶后）。图1b为AngII-Ag₂S NDs的透射电子显微镜（TEM）照片。通过1200nm光监控AngII-Ag₂SNDs与受损心肌组织的结合（图1c），808nm二极管激光器以相对低功率密度（0.2W·cm^-2）照射，InGaAs红外照相机收集和记录Ag₂SNDs产生的荧光。在静脉注射后的第一个小时内，每5min获取一次荧光图像。非靶向对照实验采用PEG化的Ag₂S纳米粒子（PEG-Ag₂S NDs）。两种纳米粒子表面修饰不同，但流体动力学半径非常相似，接近10nm（图1d，e），且已知这两种不同的功能化不会在粒子的发射光谱中产生任何相关变化。



图1（a）体内成像实验程序示意图。（b）Ag₂S NDs透射电子显微镜图像。（c）790nm光激发下Ag₂S NDs胶体悬浮液的发射光谱。（d，e）分别是AngII化和PEG化的Ag₂S NDs的DLS图。

图2a为静脉注射Ag₂S NDs后10min（诱导梗塞后40min）获得的小鼠体内光学图像、NIR-Ⅱ荧光图像及融合图像。包括进行梗塞手术并注射AngII-Ag₂S NDs（上）、手术并注射非靶向PEG-Ag₂S NDs（中），以及假手术（无梗塞）并注射靶向AngII-Ag₂S NDs（下）后获得的NIR-II荧光图像。可见上行显示AngII-Ag₂SNDs在梗塞心脏优先积聚。相反，在没有梗塞或使用PEG-Ag₂S NDs时，由于纳米颗粒在肝脏中的滞留，在腹部有优先积累。图2a的NIR-Ⅱ荧光图像显示AngII-Ag₂S NDs具有体内靶向能力，及其对急性损伤心肌组织的优先粘附。结果表明静脉注射后，AngII-Ag₂S纳米颗粒仅优先积聚在受损的心肌组织中，此时AngII为其表面配体。对照实验表明在没有靶向或没有心肌梗塞的情况下，心脏中不会发生积聚。

进行时程研究以评估优先靶向受损心肌的速度。图2b为静脉注射AngII-Ag₂S NDs后，三只诱发梗塞的小鼠心脏和肝脏中产生的NIR-Ⅱ荧光的平均时间演变，显示AngII-Ag₂S NDs快速积聚于梗塞心脏。且积聚主要在静脉注射后的前10min内产生。图2b包括肝脏中积累的Ag₂S NDs产生的NIR-Ⅱ荧光信号的时间演变。与在心脏观察到的情况相反，肝脏产生的NIR-Ⅱ荧光信号随时间单调下降，表明肝脏最初的滞留可能随后逐渐释放。图2c为三只急性梗塞小鼠静脉注射PEG-Ag₂S NDs后，心脏和肝脏累积产生的NIR-Ⅱ荧光强度的时间演变。这种情况下两器官产生的NIR-Ⅱ强度的时间演变模式完全不同。肝脏优先滞留，即使时间很短。静脉注射后肝脏产生的NIR-Ⅱ强度几乎保持不变，表明PEG-Ag₂S NDs在肝脏长期滞留。同时，心脏处没有观察到显著的优先积累。注射后短时间内，PEG-Ag₂SNDs经循环系统出现在心脏中。然而PEG-Ag₂S NDs在心脏中产生的NIR-Ⅱ荧光随时间单调减少。图2d为假手术组的时间进程，显示AngII-Ag₂S NDs在肝脏积累，且信号随时间持续下降。短时间内在心脏中观察到的最小信号也随时间快速降低。表明在健康心脏中，AngII-Ag₂S NDs的积累可以忽略不计，也证明当没有发生心肌梗塞时，AngII-Ag₂SNDs清除良好。图2b-d的时间曲线不仅揭示AngII-Ag₂S NDs在急性心脏病发作后选择性靶向受损心肌的适用性，此外短时间内（射后10min）即出现选择性积聚，足以观察到来自缺血心肌组织的清晰和特异性信号，证明了其快速诊断的能力。


图2 （a）三种情况下的光学、NIR-Ⅱ荧光和融合图像。（b）急性梗塞并静脉注射AngII-Ag₂S NDs后，三只小鼠心脏和肝脏中的平均NIR-Ⅱ发光强度的时间过程。（c）急性梗塞并静脉注射PEG-Ag₂S NDs后，心脏和肝脏的平均NIR-Ⅱ发光强度时间进程。（d）非梗塞并注射AngII-Ag₂S NDs后，心脏和肝脏的平均NIR-Ⅱ发光强度时间过程。

缺血小鼠和假手术小鼠静脉注射AngⅡ-Ag₂S NDs后，记录股动脉产生的发光强度的时间演变以评估粒子循环时间特征。两种情况下，由血流中循环的AngII-Ag₂S NDs产生的NIR-Ⅱ荧光表现出持续约2min的初始增量，与注射的NDs完全汇入血流中所需的时间相关。2min以后两种情况下都观察到强度单调下降。反映了NDs的循环时间有限，且与心肌是否有损伤无关。两种情况下评估的衰变时间都是500s。因此可得出结论，不管心肌有无损伤，AngⅡ-Ag₂S NDs的循环时间约20min。

为进一步证实图2a中心肌检测到的体内NIR-Ⅱ荧光信号与Ag₂S NDs的存在明确相关，在注射纳米颗粒后1h处死动物，立即解剖心脏并通过NIR-Ⅱ光谱成像进行分析。图3a为1000、1200和1500nm处获得的体外心脏发光图像。梗塞+AngⅡ-Ag₂S组（图3a上）中，1000nm和1500nm都没有观察到发光，1200nm处的荧光图像显示心脏顶部产生清晰信号，该处心肌组织损伤最严重。而1200nm处检测到荧光表明发光对比度是由AngⅡ-Ag₂S NDs提供的。图3b为心脏顶部区域的发射光谱，与胶体悬浮液中Ag₂SNDs的发射光谱匹配良好（图1c），表明观察到的发光可归因于AngⅡ-Ag₂S NDs对缺血心肌的选择性附着。梗塞+PEG-Ag₂S组（图3a中）中，1200nm处仅观察到非常微弱的信号，表明NDs的积累很少。图3b数据显示该情况下的发射光谱是以1200nm为中心的宽带，这可能是缺血心肌组织中存在少量PEG-Ag₂S NDs，似乎是缺血心肌组织渗透性和滞留效应（EPR）增强所致。最后，未梗塞+AngⅡ-Ag₂S NDs组（图3a下）同样在1000和1500nm处没有观察到信号，且1200nm处获得的荧光图像勉强高于背景。图3b中的光谱与Ag₂S NDs的发射光谱不相似，表明在健康心脏中的累积可以忽略不计，同时为了增加AT1R的表达和累积，缺血事件是必要的。

氯化三苯基四氮唑（TTC）染色进一步证实了这些发现，证实对照心脏（假手术）没有显示损伤，梗塞的心脏的损伤组织主要位于尖端。

为进一步分析梗塞的存在和AT1R的过表达的关联，对梗塞心脏样本进行qt-PCR。图3c为健康心脏（假手术心脏）和梗塞心脏的AT1R表达百分比。可见假手术组呈现AT1R低表达，而受损心肌组中显著升高。将图3c数据与图3b中的发射光谱的积分强度相关联（图3d），显示了AngII-Ag₂S NDs用于检测缺血心肌的靶向效率，以及量化信息。图3c中可见梗塞引发的AT1R表达的相对增加小于50%，而与AngII-Ag₂S NDs选择性积累相关的NIR-Ⅱ荧光信号显示增加了10倍，再次反映出AngII-Ag₂S NDs在短循环时间内的高效靶向性。


 图3（a）三种不同发射波长（1000、1200和1500nm）下的离体荧光图像，对应不同处理组。（b）对应的发射光谱。（c）假手术小鼠和心肌梗塞小鼠心肌组织中AT1R的mRNA水平。（**p < 0.01）。（d）健康心脏（假+ AngII-Ag2S）、静脉注射PEG-Ag₂S NDs后的梗塞心脏（梗塞+PEG-Ag₂S）和静脉注射AngII-Ag₂S NDs后的梗塞心脏在1000-1600nm范围内的发射强度。
 

最后通过评估生物分布模式，研究了AngII-Ag₂S NDs的AT1R靶向能力。获得三种情况下各器官的NIR-Ⅱ发光图像（图4），显示PEG-Ag₂S NDs优先在肝脏和脾脏中积累，而其他器官没有出现明显的红外发光。无梗塞的对照组中也观察到肝脏和脾脏积聚。而在梗塞后注射AngII-Ag₂S NDs的小鼠器官中，仅在心脏和肺中可见发光，没有观察到肝或脾对AngII-Ag₂SNDs的实质性保留，与图2b数据非常一致。但对每个器官中的发光进行单独定量证明有残余发光信号，证实肝脏和肠道中均存在Ag₂S NDs。生物分布模式（图4b,c）显示，对于梗塞和健康心脏，一些荧光是从肝脏、脾脏和肠道产生的。然而以图4a中最大强度标准化后，很难直接观察这些特定器官的荧光。分析肝脏和肠的离体荧光图像表明，PEG-和AngII-功能化的Ag₂S NDs通过胆汁途径和粪便排泄优先清除，与已有研究结论一致。肺中AngⅡ-Ag₂SNDs的积聚可解释为肺泡-毛细血管屏障功能障碍，这可能导致肺充血。此外，即使使用伤害最小的呼吸机，机械通气可能也会引发呼吸机引起的肺损伤（VILI）。肺血管紧张素受体的上调可能是炎症反应的一部分。

 
图4（a）不同处理小鼠解剖离体器官的NIR-Ⅱ荧光图像。（b）急性梗塞后静脉注射PEG-Ag₂S NDs和（c）AngII-Ag2SNDs，在不同器官中产生的发光强度直方图。

结论

本研究使用近红外二区发光的Ag₂S NDs实现了急性梗塞后快速、高选择性的体内心脏成像。结果证明急性梗塞后AT1R受体的过表达可使静脉注射的AngII-Ag₂S NDs瞬时（< 10min）并选择性靶向缺血心肌组织，使得在最早的时间内对急性梗塞损伤心脏进行体内可视化成为可能。与离体器官光谱图像的比较再次证明了AngII-Ag₂S纳米粒子的高特异性，即使全身注射也能附着到缺血性心肌组织。

本研究介绍的近红外二区发光纳米粒子可在小动物模型中对急性梗塞后的心脏进行快速体内成像和诊断。这是临床前心肌梗塞早期快速诊断的第一步，有助于开发新的治疗方法。此外AngII-Ag₂S NDs的高靶向能力也为新疗法开启了思路，如药物递送或利用Ag₂SNDs实现同时局部高热和非接触式热传感。
 

参考文献：Mateos S ,  Lifante J ,  Li C , et al. Instantaneous In Vivo Imaging of Acute Myocardial Infarct by NIR-II Luminescent Nanodots[J]. Small, 2020.