ROC Analyst：高光谱受激拉曼散射显微术对植物组织进行高光谱化学成像

受激拉曼散射（SRS）显微术利用基于分子振动特征的化学特异性，可实现无标记生物成像。超光谱SRS成像可以获得每个像素的分子振动光谱，不仅能够研究各种生物分子的光谱差异，还可根据它们的光谱差异区分出不同成分。然而由于光谱差异的细微性，以前的无标记SRS成像可辨别的成分的数量只有4个。日本研究人员Takanori Iino等使用高光谱SRS对植物组织进行了成像，包括山茶（Camellia japonica）叶子、拟南芥（Arabidopsis thaliana）根和苔类植物（Marchantia polymorpha L）的叶状体。表明SRS可以在没有标记的情况下区分苔类植物中多达6种成分。结果证明超光谱SRS成像可用于无标记多色成像分析植物组织中的各种生物分子。文章以“Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulatedRaman scattering microscopy”为题发表于ROC Analyst。
 
背景

观察各种生物分子的分布对理解生命系统的机制很重要。受激拉曼散射（Stimulated Raman scattering, SRS）显微技术可实时获取分子振动图像并得到广泛应用，如无标记成像各种细胞和组织中的生物分子、代谢成像、超多路成像。近期开发出的几种超光谱SRS成像方法可以获得每个像素的分子振动光谱，以区分出不同化学成分，实现多色无标记成像。

但高光谱SRS显微术辨别不同分子的能力还有待充分开发。考虑到典型生物分子的光谱宽度（约10cm^-1）与碳-氢（C-H）拉伸区宽度（约200cm^-1）之比，原则上高光谱SRS可以根据分子振动光谱的差异区分多达10种以上成分。而事实上在C-H拉伸区高光谱SRS成像可以区分的成分数量通常为3-4个，因为典型的生物分子在C-H拉伸区往往具有相似的光谱。高光谱SRS图像的光谱相量分析不仅可以利用光谱特征差异，还可利用强度差异在哺乳动物细胞中实现五种成分分类，但这种分类缺乏形态学细节。有报道在指纹区对植物组织进行拉曼成像应用，指纹区光谱特征比C-H拉伸区更丰富，最终多元分解出6种成分。然而拉曼成像受到各种背景信号的影响，可能会影响分解结果，因此不同的分解算法间似乎仍然难以获得一致的结果。

本研究在C-H拉伸区使用超光谱SRS显微技术，证明能够对完整植物组织进行无标记多色成像。具体而言，对山茶叶（Camellia japonica）进行三色成像，对拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶、初生根顶端和中部进行四色成像，对苔类植物（Marchantia polymorpha L.）叶状体进行六色成像。预期在植物组织中生物分子组成研究方面，超光谱SRS显微术能够成为一种有效的无标记成像分析工具。


 图1 自制SRS显微镜示意图。使用（i）双色同步皮秒泵浦脉冲和波长可调的斯托克斯脉冲；（ii）由共振振镜扫描仪和普通振镜扫描仪组成的X-Y扫描仪；（iii）物镜将泵浦和斯托克斯脉冲聚焦到样品上（下）并收集通过样品传输的脉冲（上）；（iv）提取泵浦脉冲的滤光器，泵浦脉冲由硅检测器检测，硅检测器连接到自制的锁定放大器以获取SRS信号。

结果

首先获得山茶（Camellia japonica）叶子的SRS成像。图2a为叶子的数据集举例。从测量的超光谱SRS数据中手动提取光谱基（图2b）。根据光谱形状和形态推测，2940cm^-1处显示峰（CH3拉伸模式）的是细胞壁（黄线）、2850-2930cm^-1处显示平坦响应（烷基链）的是饱和脂肪酸（品红线）、源于约3200cm^-1处羟基拉伸模式的低波数尾部的是水（黑线）。各成分的图像如图2c所示。合成的多色图像如图2d所示，其中品红色和黄色部位的形态与角质层蜡质层和细胞壁的形态一致。另外这些成分的重叠分布（双向箭头所示的黄褐色部位）证实了细胞壁-角质层连续体的存在，其作用是调节分子运输进出植物体，影响对不同病原体感染的反应。



图2 山茶花一片叶子的SRS成像。（a）叶片横截面积的SRS图像数据集示意，由91幅光谱图像组成。为清晰起见对图像进行了裁剪。（b）用作光谱基的振动光谱。（c）每种成分的图像。（d）多色图像。比例尺10 μm。双向箭头表示细胞壁-角质层连续体。

图3为拟南芥（Arabidopsis thaliana）的SRS图像，拟南芥是植物分子生物学和遗传学研究中的典型模式物种。具体来说，对莲座叶和初生根的中部和顶端进行了高光谱SRS成像。所有拟南芥样本中，都能将SRS数据集分解成四个组成部分。在莲座叶（图3a）中，推测提取的光谱分别是细胞壁（红线）、由于双光子吸收而表现出宽光谱响应的色素（绿线）、在2850和2880cm^-1处表现出尖锐峰的蜡酯（蓝线），和水（黑线）。分解组分的空间分布与细胞形态一致。

在初生根的中部（图3b）鉴别出四个光谱，推测为次生细胞壁（红线）、在2930cm^-1处显示峰值，在2910cm^-1处信号比木质素小的蛋白质（绿线）、在2850至2930cm^-1处显示平坦响应（烷基链）的饱和脂肪酸（蓝线）、水（黑线）。同样，分解成分的空间分布与导管中次生细胞壁、胞质溶胶和木栓质层的形态一致，其中木栓质层似乎存在于内皮层细胞的表面，这意味着可以观察到凯氏带（Casparian strip），一种细胞壁材料的带，类似沉积在内皮层径向和横向壁中的栓蛋白。

在初生根的顶端（图3c），推测光谱是细胞壁（红线）、蛋白质（绿线）、在2910cm^-1处有峰的多糖（蓝线）、和水（黑线）。分解成分的空间分布与细胞壁、胞质溶胶和积累淀粉的淀粉质体的形态一致。由此使用SRS显微术可以无标记的方式获得四色图像。

 
图3 拟南芥叶片和初生根的SRS成像。（a）莲座叶。（b）初生根的中部。（c）初生根的尖端。（i）、（ii）和（iii）分别为用作光谱基的提取光谱、每种成分的图像和合并的SRS图像。（a）-（c）中的（iii）合并图像显示了各种结构，如（a）中细胞壁（红色）、叶绿素（绿色）和角质层（蓝色）；（b）中次级细胞壁（红色）、胞质溶胶（绿色）和存在于内皮层细胞表面的片层上的木栓质层（蓝色）；（c）中细胞壁（红色）、胞质溶胶（绿色）和淀粉体（蓝色）。

图4为地钱（Marchantia polymorpha L.）叶状体的SRS图像，提取了六个光谱（图4a）用作光谱基。推测提取的光谱为：范围2850-2930cm^-1宽光谱（烷基链），在3010cm^-1处具有尖峰（C-C双键相关的C-H拉伸模式）的不饱和脂肪酸（红线）、色素（绿线）、油体中包含的次级代谢物（可能是萜类化合物和芳香成分的高度多样混合物）（蓝线），其在2910cm^-1（CH₂反对称拉伸模式）和3050cm^-1（芳香C-H拉伸模式）显示出强峰、饱和脂肪酸（品红线）、细胞壁（黄线）和水（黑线）。图4b显示了分解成分的空间分布，与脂滴、叶绿体、油体、角质层蜡层和细胞壁的形态一致。图4c为叶状体的合并SRS图像，展示了通过超光谱SRS成像获得的无标记六色成像图。



 图4 地钱（Marchantia polymorpha L.）叶状体的SRS成像。（a）提取光谱用作光谱基。（b）每种成分的图像。（c）合并的SRS图像，显示不同结构：脂滴（红色）、叶绿素（绿色）、油体（蓝色）、角质层（洋红色）、细胞壁（黄色）。（d）地钱全株的照片。

结论

本文利用高光谱SRS成像展示了各种类型植物组织的多色无标记成像，实现了通过线性解混方法区分微小的光谱差异。鉴于叶绿体、细胞壁和液泡等细胞器中积累的色素的自发荧光通常会妨碍荧光成像，高光谱SRS成像将特别适用于植物组织复杂结构的成像分析。

但该方法一个重要的技术挑战是高光谱SRS数据集中成分的自动分类。本研究的光谱基是通过研究许多像素的光谱来手动提取的，既费时又费力，而且一旦它们反映的不是纯成分，则伪矩阵反演给出的图像也是成分的混合体。此外如果一些谱基不是线性独立的，伪矩阵反演会产生噪声图像，这可表明组分的数量。目前还没有成功量化光谱分析的准确性。虽然已有各种自动提取光谱基或分类不同细胞成分的算法，但使用这些算法提取多达六个成分似乎仍然较为困难，仍需要开发新的分类方法。

总之本文证明了超光谱SRS显微术可用于植物组织的无标记多色成像，利用其分子识别能力，可对多达六种成分进行无标记多色成像。随着光谱提取方法的发展，超光谱SRS显微术的能力将得到进一步发展，成为植物组织无标签多色成像分析的有力工具。

 参考文献：Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.