天冬氨酸异构化的定量及糖链分析流程
| 领域： | 生物制药/仿制药 | ||
| 样品： | 生物制药，蛋白，抗体 | 项目： | 天冬氨酸异构 |
Protein Metrics Insights本月起上线了！Insights将为大家介绍一些比较广泛关注的关于软件使用的问题。本期Protein Metrics Insights中，我们将讨论如何对异构化的天冬氨酸进行定量，这也是生物制药表征中的关键质量属性，并介绍了Byos中新上线的游离糖链分析流程。
天冬氨酸异构化的定量
天冬氨酸（Asp，D）和异天冬氨酸（isoAsp，isoD）残基在CID或HCD碎裂模式下是不可区分的， ETD的碎裂模式下，Byonic和Byos可以通过自动识别特征离子z-57和c+57对其进行注释。通常具有D和isoD的肽段在软件中是以同一个Wildtype（未修饰的）肽段的形式显示的，为了计算异构化的相对量，需要将异构的肽段通过保留时间区分并进行定量。
目前在Byos中有手动，半自动和全自动方法来计算每种异构体的相对含量（％PTM），所有这些方法都涉及为含有isoD的肽段创建新肽段并对其进行标记，这样就能够在报告中生成相对百分含量。
下面我们将介绍天然Asp残基的异构化（D→isoD）定量过程，对于Asn脱酰胺形成的异构化的定量（N→D或N→isoD），请参阅我们网站上的应用文献——“PTM Analysis: Asparagine Deamidation Quantified by Byologic”。
半自动化方法
Byos（或Byologic）默认可以检测到多肽XIC中有多个洗脱峰，多个XIC被称为XIC Proposals。XIC Plots视图中可以对XIC Proposals栏进行选择，并得到如下的视图：
操作人员可以在Peptides表中右键单击相应的肽段，然后单击Apply applied XIC splits。这将创建一个新的in-silico肽，并且肽段的XIC自动按照XIC Proposals设置。为了区分D和isoD异构体，将Label添加到新创建的肽中，例如，“isoD”。
全自动方法
当Wildtype肽段显示多个洗脱窗口并且序列中含有预定义的motif（例如DG，DS）时，Byos/Byologic可以自动创建新肽段并将异构体体标记为“isoD”。自动拆分和加入标签需要在项目创建时输入如下Advanced commands 。
[Byologic]
AutoSplitPeptides = DG | DS | DD
AutoSplitPeptidesLabels = IsoAsp
[MSFeatureAlign]
Mode = DifferentTopologyOnly
[MSFeatureFinderSeg]
AUCNegligibleRatio = 0.0005
ScoreNegligibleRatio = 0.0005
手动方法
虽然需要更多的手动操作，但是手动方法是最直接的。手动方法需要右键单击Wildtype肽段并点击Create new peptide from current...将创建一个新的肽段。需要注意，新产生的肽段的“in silico”列将显示“Yes” ， Mod. Summary 列仍为空，因为Byologic只是复制了Wildtype肽段信息。为了区分新肽，需要将Label添加到该肽段中。在这里我们将其标记为“isoD”。
最后，需要将两条肽段的XIC interval分别更改为D和isoD肽段的保留时间范围，这样isoD的相对丰度将自动显示在报告表中。
报告
所有上述方法中， isoD肽段的相对丰度可以自动计算并在报告中显示。默认PTM报告的第四个选项卡“％Mod（Multi Mods per Peptide）”自动执行此操作，默认情况下会隐藏未修饰肽段，此处需要操作显示Wildtype肽段。请参阅下方屏幕截图中的说明。
下表中，肽段FNWYVDGVEVHNAK的D和isoD肽段的相对丰度的计算显示在四个样品中。计算方式是通过XIC值的百分比：XIC_isoD /（XIC_D + XIC_isoD）。以下数据显示，与参照相比，Stressed样品中isoD丰度明显增加。
Byos ®中的游离糖链分析流程
Protein Metrics Byos最近推出了用于N-连接和O-连接游离糖链的分析流程。默认情况下，每个工作流程都设置了与其对应的糖链数据库，处理参数和报告模板。分析过程涉及将匹配的游离糖链标注于TIC / BPI，UV或FL的相应色谱峰。匹配既可以使用MS1精确质量数，也可以在没有质谱数据的情况下，利用保留时间信息来完成。这些工作流程可以分析正离子模式和负离子模式MS数据，参数设置中也可以选择常用标签列表，例如2-AB，2-AA等。此外，用户还可以定义自定义标签，并可以定义谱图匹配时可能存在的加合物。通过游离糖链的分析流程，可以满足日常对于糖链定性和定量的分析需求，进一步提升分析的能力。
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