台湾国立东华大学开发出MALDI样品快速制备新方法

近日，台湾国立东华大学彭文平教授团队开发了一种基质辅助激光解吸/电离（MALDI）样品制备新方法——强制干燥液滴法（FDD），可以克服传统干燥液滴（DD）法的缺点。由DD方法产生的晶体是不均匀的并且不规则地分布，因此许多方法试图解决这些问题。但是，大多数人花费了更多时间或需要额外的仪器来产生均匀微晶。FDD样品制备方法可以在几分钟内产生尺寸均匀分布的微晶，无需额外的仪器。相关研究成果已经发表在Analytica Chimica Acta上。

基质辅助激光解吸/电离（MALDI）是由Tanaka、Karas和Hillenkamp于1988年开发的，是分析宽质量范围生物分子（包括肽、蛋白质和合成聚合物）的重要工具。为了制备MALDI样品，已经引入了几种方法：干滴（DD）法，真空干燥结晶法，快速蒸发法，覆盖层（例如双层，多层）法，夹层法，基质升华/重结晶法，慢结晶法（ 生长大晶体）方法，固/固晶体压缩方法，基质–混合基质样品制备方法等。

DD方法是制备MALDI样品最常用的方法，因为它的样品制备很简单，可以为许多不同类型的样品产生良好的结果。然而，它需要手动搜索分析物掺杂的基质晶体以产生高质量的质谱，因为不均匀的斑点会导致靶板上的不均匀晶体尺寸分布，即“热/甜”点。在这方面，DD方法被认为对于定量应用是不切实际的。为了解决样品晶体分布不均匀的问题，下面的方法被开发出来。真空干燥结晶方法是DD方法的修改版本。样品点在真空室中快速干燥，从而通过降低偏析效应来改善晶体均匀性。然而，该方法并不总是改善DD方法的离子信号，并且还需要真空设备来制备样品。快速蒸发（FE）方法和双层（TL）方法都可以在几分钟内制备样品。FE法不能重现蛋白质混合物样品间的数据，而TL方法具有更好的样品间重现性，因此，普遍采用TL方法为大规模和高通量应用制备均匀的样品表面。然而，对于TL方法，需要一定类型的有机溶剂和pH调节剂来改变第二层溶剂条件以获得所需的结果。夹层法源自FE和TL方法，将最小检测水平扩展到阿摩尔范围。分析物夹在快速蒸发的仅基质床和第二基质层之间。需要手动移液或使用机器人技术的额外步骤。基质升华法需要升华基质以在样板上产生均匀的小晶体层。这种方法需要更长的时间（约1小时）来准备样品表面，需要在高温下操作（110~190 ℃）和压力设置。慢结晶方法可以从复杂混合物（如多肽）的高质量组分中获得优异的质谱，但大晶体的生长需要数小时。与FE和TL方法相比，固/固压缩（晶体破碎）方法需要更多时间。基质/共基质样品制备方法需要适当选择不同的基质组合。最近，通过改变基板温度还引入了基于电润湿的e-MALDI样品制备方法以及干燥液滴内的Marangoni流动以降低空间不均匀性，但是这两种技术都需要特定的仪器来制备样品表面。

在彭文平教授的研究中，开发了强制干燥液滴法（FDD）来克服DD方法面临的不均匀的粒度分布问题。与试图形成均匀晶体的其他方法相比，FDD方法简单，直接且省时。它可以通过触发二次成核在样品表面上产生均匀的分析物-基质晶体，二次成核是通过采用外部物理力实现的，即用移液管尖端搅拌样品点溶液。搅拌样品点溶液（搅拌过程）与二次核形成的速率相关。由于样品的结晶是通过外部物理力实现的，因此该方法称为强制干燥液滴法（FDD）。

CHCA基质与肌红蛋白样品表面显微镜图像，（a）DD方法，（b）TL方法，和（c）FDD方法。 每个图片的10倍放大图像放在右侧，带有比例尺。 

使用（a）DD方法，（b）TL方法和（c）FDD方法将肌红蛋白与CHCA基质混合的质谱。 恒定激光能量~3.9 mJ和1550 V检测器电压用于获取所有方法的质谱。

FDD方法原理：

晶体形成涉及两个连续的步骤：成核和晶体生长。DD方法的样品制备中的晶体形成不同于FDD方法的晶体形成。对于DD方法，分散在过饱和溶剂中的溶质基质分子在溶液中自发形成核;随后，晶核变成晶体。然后，在存在过饱和的同时，成核和晶体生长继续同时发生。晶体生长比成核过程快，这导致了大尺寸晶体的形成。对于FDD方法，搅拌溶液（搅拌过程）诱导母核并随后进行初级晶体生长。连续搅拌使初级晶体破裂并使溶液中的细颗粒发生摩擦。这些细颗粒为二次成核提供了活性位点。二次成核的有效速率取决于细颗粒产生速率和成核效率。

该研究通过显微镜成像确认搅拌对样品表面微晶生长的影响。在整个样品表面区域，微晶的尺寸小于10μm。与标准DD法和TL法相比，使用这种新的FDD方法的质谱和样品表面的显微图像都表明形成了均匀的分析物-基质晶体。与DD方法相比，使用FDD方法，发现用芥子酸基质离子强度增加约3~5倍，或用α-氰基-羟基肉桂酸基质增加7~10倍。此外，用FDD方法得到的质谱与TL方法具有可比性，可用于蛋白质样品的大范围质谱分析。

研究结果表明，用移液管尖端搅拌样品点溶液（搅拌过程）可以改变显微镜观察到的晶体尺寸分布。FDD方法可以产生致密且均匀分布的分析物-基质微晶，尺寸小于10μm。通过FDD方法形成微晶与二次成核的有效速率有关，而二次成核的有效速率取决于细颗粒的产生速率和成核效率。它也是检测具有良好离子信号的宽质量范围蛋白质的有效方法。质谱分析表明，晶体尺寸越小，离子信号强度越好。FDD方法的相对标准偏差（RSD）为~16％，与两层（TL）方法相当，优于DD方法。此外，不像TL方法，FDD方法不需要额外的层（种子层），因此，它是直接、简单和快速的（约3分钟）。用FDD方法，分析物-基质晶体可以均匀分布在整个样品点上。因此，FDD方法可用于MALDI TOF-MS的定量应用。

样品前处理一直是制约着MALDI质谱技术应用和发展的因素之一, 而基质在待测样品上分布的均匀度、结晶度和晶体颗粒的大小等因素决定着质谱成像的质量。要尽可能的满足基质能与待测物形成良好的共结晶，均匀分布，且其颗粒大小越小越好，以协助目标分子的高效电离。彭文平教授团队研究出的FDD样品制备方法，可以产生致密且均匀分布的分析物-基质微晶，尺寸小于10μm，可用于MALDI TOF-MS的定量应用。

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FDD法如果能与融智生物QuanTOF平台的卓越性能相结合，相信MALDI质谱分析技术一定能获得更好的分析结果。