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人类巨细胞病毒疫苗全球临床实验新进展|全自动毛细管Western技术再次助力Merck公司疫苗研究
继全自动毛细管Western Blot助力Merck公司全球首个预防埃博拉病毒病的商品化疫苗ERVEBO®上市后，近日，Merck公司疫苗分析研究进展与疫苗工艺开发部门再发文章：利用还原全自动毛细管Western Blot技术，定量人巨细胞病毒疫苗多种抗原水平，同时利用非还原的方法表征抗原蛋白额外二硫键和MW信息（多聚体抗原水平）。同时Merck公司还利用此方法确定了一些HCMV病毒中以前未知的生化特征：非还原条件中，病毒表面蛋白的三重gH峰，这可能会为HCMV病毒抗原的特异性测试提供一种新的策略。
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人类巨细胞病毒
人类巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)，属于β疱疹病毒亚科。根据地域的不同，世界上50%到90%的成年人口曾感染过HCMV。尽管感染HCMV很少会在健康成人中引起症状，但它却是引起移植受者器官衰竭的主要原因。同时感染HCMV会对人类整个生命周期的健康造成威胁：对先天性感染的儿童造成神经系统异常；对免疫抑制患者（移植病患或者免疫缺陷疾病AIDS患者）出现较高的发病率和死亡率；同时还会增加老年人死亡率、心血管疾病和癌症的风险。
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人类巨细胞病毒结构
HCMV具有一个二十面体衣壳，其中包含双链DNA，编码165种蛋白质。衣壳被蛋白质包膜包围，外部被一个脂质包膜包围，其糖蛋白通过与细胞膜融合进入宿主细胞。融合后，DNA和被膜蛋白被释放到细胞中。该病毒包含不同类型的糖蛋白复合物(glycoprotein complexes, gC)，用于感染宿主细胞：gC-I是由糖蛋白B(glycoprotein B, gB)的同源三聚体组成的复合物，糖蛋白B(gB)是一种泛疱疹病毒科保守的糖蛋白，介导膜融合过程：即介导病毒进入细胞期间从融合前的构象重新排列为融合后的构象；gC-II是含量最丰富的gC，由糖蛋白M（glycoprotein M, gM）和N（glycoprotein N, gN）组成，有助于与细胞膜的初始结合，并在病毒复制中起作用；gC-III，现在称为三聚体复合物(Trimer complex, TC)，是一种异源三聚体复合物，其中糖蛋白H(glycoprotein H, gH)、L(glycoprotein L, gL)和O(glycoprotein O, gO)连接在一起，gH和gL参与激活gB的融合活性，gO作为共同受体。还有一种五聚体复合物（Pentameric complex, PC）由gH/gL与UL128、UL130和UL131蛋白（pUL128–pUL131）组成，主要感染上皮细胞和内皮细胞，有研究发现这种五聚体复合物（PC）对于引发保护性体液免疫反应很重要，在自然感染中占>85%的中和活性。
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全球HCMV疫苗临床实验进展
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全自动毛细管Western Blot定量HCMV减毒活疫苗抗原
全自动毛细管Western Blot：基于毛细管电泳的免疫学检测方法，只需3μL样本，一次性加好样本和反应试剂（blocking液、一抗、二抗、显色液、洗液），开始上机实验，仪器自动上胶、加样、跑胶、紫外交联蛋白、一抗二抗孵育、显色定量，CCD相机直接获取化学信号，不出3小时直接获得24个样本定量结果。此过程除手动加样后，无需任何手动操作，数据稳定重现性佳（Merck结果CV<10%：见文章：全自动毛细管Western Blot助力全球首款埃博拉疫苗ERVEBO®上市）。
Merck公司正在进行的减毒活病毒HCMV疫苗（V160）的II期临床试验中，在减毒活AD169病毒株表面恢复了五聚体复合物。因此重建的HCMV病毒含有多种表面糖蛋白：五聚体gH/gL/gUL128-131复合物、三聚体gH/gL/gO复合物、gB糖蛋白和gM/gN异二聚体复合物。因此Merck公司利用全自动毛细管Western Blot定量的方法，监测在疫苗开发过程中的多种病毒表面抗原。
还原毛细管Western Blot法鉴定9种抗原蛋白
在无(-)和有(+)PNG-F酶处理的情况下，还原毛细管Western Blot法鉴定HCMV中的9种糖蛋白：gH、gL、UL128、UL130、UL131、gO、gB、gM和gN。
原始峰形图（PNG-F酶处理前为蓝色峰，PNG-F酶处理后绿色峰）显示，PNG-F处理后的MW shift 取决于每个糖蛋白上有多少N-连接的聚糖位点。N-连接的聚糖位点越多，偏移越大。例如有18个N-连接的聚糖位点的gO（偏移很大）和不含N-聚糖位点UL128（两峰趋近一致）。
非还原毛细管Western Blot法鉴定不同聚体复合物
毛细管Western Blot可以提供特定病毒抗原的额外二硫键和MW信息。例如用非还原毛细管Western Blot检测发现，用抗gH抗体观察到~90kDa、~120kDa和~205kDa的三重峰。当使用抗gL抗体时，仅观察到120kDa和205kDa处的两个峰。当用抗UL128和抗gO抗体探测时，分别检测到120 kDa和205kDa处的峰。这些数据明确表明，120kDa处的峰分配是由于gH-gL-UL128复合物，它是五聚体复合物(gH-gL-UL128-UL130-UL131)的一部分，其中UL130和UL131是非共价结合的。在205kDa处观察到的峰被确认为gH-gL-gO三聚体复合物。
在原始峰形图上观察到的三联体的gH峰，并不是HCMV疫苗病毒(V160)独有的，因为两个临床分离株的HCMV也显示了三联体的gH峰。因为AD169病毒株没有五聚体复合物(gH-gL-UL128-UL130-UL131)，所以不显示~120kDa的峰。同时结果也表明V160中gH单体(~90 kDa)和gH-gL-gO三聚体复合物(~205 kDa)的相对ratio与亲本病毒AD169相当。
用抗gM和gN抗体检测到，在~138kDa 和236kDa处具有相同的两个峰：138kDa峰可能是实际的gM/gN复合物，而236kDa为二聚体(gM/gN)2。
毛细管Western Blot监测疫苗发酵工艺
利用特异性的三重gH峰面积可用于评估发酵过程中对五聚gH复合物的潜在影响。对九个开发批次的V160中，对五聚体gH复合物百分比进行了比较。第1至第4批是在工艺优化之前生产的，与工艺优化后生产的第5至第9批相比，其gH-gL-UL128（五聚体复合物）含量较低。
同时毛细管Western Blot结果表明，五聚体的产量在感染后11-13天开始趋于稳定。此外与生物反应器3和4相比，生物反应器1和2提供了更好的五聚体表达。这一观察结果与微流式细胞仪测量的病毒颗粒浓度相吻合。
毛细管Western Blot绝对定量五聚体抗原
毛细管Western Blot绝对定量法的线性、R2、精密度、准确度如图所示，揭示了毛细管Western Blot绝对定量法可以用于定量HCMV的糖蛋白。
用重组五聚体蛋白作为标准品，利用毛细管Western Blot绝对定量法绘制标准曲线（图A-C），用此方法定量疫苗样本中的五聚体抗原（图D）。
与Elisa法定量疫苗样本中的五聚体抗原相关性R2=0.9941.
结论：
利用毛细管Western Blot方法检测抗原蛋白，不需要纯化样品，因此该方法适用于分析多种样品类型中的目标蛋白，例如来自感染细胞培养物的上清液、纯化中间体、浓缩液和最终疫苗产品。同时此方法不只可以定量抗原蛋白，还可以利用非还原的方法表征抗原蛋白额外二硫键和MW信息。在此方法中还确定了一些HCMV病毒中以前未知的生化特征：非还原条件中，病毒表面蛋白的三重gH峰，这可能会为HCMV病毒抗原的特异性测试提供一种新的策略。
参考文献：
1. Characterization of gH/gL/pUL128-131 pentameric complex, gH/gL/gO trimeric complex, gB and gM/gN glycoproteins in a human cytomegalovirus using automated capillary western blots, Vaccine. 2021 Jul 3.
2. Cytomegalovirus as an immunomodulator across the lifespan, Curr Opin Virol. 2020 Oct.
3. Development of a Vaccine against Human Cytomegalovirus: Advances, Barriers, and Implications for the Clinical Practice, Vaccines (Basel). 2021 May 25.
