Jess RePlex技术：3μL样品2次连续自动检测实现多重定量Western Blot

传统的Western Blot，耗时长，手工操作多，重现性差（CV>35%）。遇到珍贵样本（蛋白量不足）通常会进行strip-reprobe（洗脱-重杂交）的方式进行蛋白质多靶点的分析。

然而，传统Western Blot进行strip-reprobe（洗脱-重杂交）时会面临：

1.洗脱次数不够，无法充分解离靶点和抗体，影响二次杂交。

2.洗脱次数太多，膜上靶点丢失太多，定量更加不准。

3.每个靶点和抗体亲和力不同，没有通用试剂和方法。

为了克服这些局限性，

ProteinSimple Jess RePlex技术正式上线！！

Jess RePlex检测技术特点：

• 只需1份3μl样本(分选干细胞、免疫微环境细胞、珍稀临床样本等）

• 2次连续自动检测：一根毛细管洗脱-重杂交技术

• 结合Jess多通道检测：化学发光、双色红外荧光、总蛋白检测通道

• 实现珍贵样品多靶点的定量检测分析（不同靶蛋白、靶蛋白不同亚型、靶蛋白磷酸化、样本总蛋白等）
  

Jess RePlex检测原理：

Jess RePlex应用举例：

RePlex超高的洗脱效率

RePlex中的关键步骤是在第一轮探测后能有效去除抗体。因此，评估了针对Jurkat和MCF7裂解物的pan AKT/AKT1/AKT2/p-AKT1/p-AKT2/p-GSK3b抗体的去除效率。结果显示，所有测试的抗体均显示出超过96％的去除效率，而大多数测试的抗体均显示出98％或更高的去除率。这些数据表明进行第二轮抗体探测时，与第一轮探测几乎没有交叉。

RePlex出色的重杂交信号强度和高重复性

为了证明探针1和探针2之间的信号强度和可重复性没有受到影响，在两个检测步骤中测量了MCF7裂解物中AKT1和AKT2抗体的信号强度。结果显示，不管检测每种蛋白质的顺序如何，在RePlex分析中在探针1或探针2中检测到的MCF7裂解物中的AKT1和AKT2在两个检测周期中均具有出色的重现性和相似的信号强度。

一份样品不同靶点的检测

RePlex检测技术可以检测同一样品中多种蛋白质磷酸化的状态变化，并对其进行定量分析（使用对照和经LY294002处理的Jurkat细胞的裂解物的p-AKT/p-GSK3b/p-cRaf的定量分析）。

一份样品相近分子量靶点的检测

利用RePlex技术表征了多种组织类型中AKT的磷酸化状态。同一毛细管中检测多种组织类型，包括肝，肾，结肠，脑，乳腺和肺中的panAKT和p-AKT。同时分析了不同组织中归一化panAKT后，p-AKT信号的变化，即不同组织显示出不同水平的AKT表达和磷酸化。

一份样品多靶点的检测

利用RePlex技术可以在第一轮免疫杂交中进行不同靶蛋白的测定，并在同一毛细管中进行第二轮总蛋白检测。利用未经处理和用人IGF1（hIGF1）处理过的MCF7细胞，第一轮检测Pan AKT（NIR通道）和p-AKT（化学发光通道），第二轮检测同一根毛细管中的总蛋白。结果显示，利用Jess不同通道以及RePlex技术可以达到一份样品获取多个靶点的定量数据。

结论：

传统Western Blot若从单个样本中获取更多的蛋白信息，即为了节省珍贵或昂贵的样品，需要进行strip-reprobe（洗脱-重杂交）。然而，众所周知该技术会遭受不可预测的蛋白质损失，并且通常需要冗长的优化以实现最佳的剥离效率并使蛋白质在印迹上的保留最大化。这使得几乎不可能使用标准的条带和探针技术进行任何定量分析。相比之下，Simple Western平台Jess开发的RePlex技术是一种优化的自动化两步免疫分析，可以实现多个靶标的高效抗体去除和出色的目标蛋白在样品毛细管中的保留，从而可以实现在一个样品中获得更多的蛋白信息。