Nanopro蛋白质翻译后修饰图谱检测技术揭示癌症干细胞表型转换新机制

意大利San Raffaele科学院再生医学及干细胞和基因治疗科的科学家，利用Nanopro 1000在Cell Death and Differentiation（IF：10.717）发表文章：The proneural gene ASCL1 governs the transcriptional subgroup affiliation in glioblastoma stem cells by directly repressing the mesenchymal gene NDRG1.

--研究背景--

癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）:通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力；通过运动和迁徙能力使肿瘤细胞的转移成为可能；可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感。

干细胞（Stem Cells）公认的功能定义是自我更新和产生分化后代的能力，因此对CSCs的定义也要证明这种功能特征：持续的自我更新；持续的增殖；二次移植后产生肿瘤的能力，即可以重述亲本肿瘤中存在的细胞异质性。除此之外，CSCs还具有与体干细胞相同的功能：包括组织（或肿瘤）内的频率，干细胞标志物的表达；以及生成多种谱系子代的能力。

胶质母细胞瘤（GBM）是最普遍，最恶性的原发性脑肿瘤，其包含自我更新的致瘤性癌症干细胞（CSCs），可以促进肿瘤的发生，并且发生治疗抗性。正常的干细胞和祖细胞可以参与组织的发育和修复，同样，CSCs可以促进肿瘤的发展和进行性生长。因此，对控制CSCs的分子机制的研究，对GBM或其它脑癌治疗可以提供新型靶向疗法的开发方向。

CSCs的调节因素包括：内在调节因子和外部调节因子。

关键的内在调节因子包括：基因组成、表观遗传、代谢调节。

外在调节因子包括：与微环境的相互作用、生态位因子、免疫系统。

根据肿瘤的基因组成预测临床过程并提供治疗方法，对于提高疗效和防止患者过度治疗至关重要。这个概念也适用于成胶质细胞瘤（GBM）。多年来，已经根据肿瘤组织学对神经胶质瘤进行了分类，再加上肿瘤分级，来反映肿瘤恶性程度并在一定程度上预测了疾病进程的分类。直到最近，2016年世卫组织脑肿瘤分类将基于异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）状态的GBM遗传分类纳入组织学标准诊断。

在可用于GBM的许多多维分子数据中，转录特征将GBM分为不同的亚组，即前神经（PN），间充质（MES），经典（CL）/增殖（P）和神经（NL）。鉴于20％的GBM并不是转录均质的，而是包含多个属于不同亚类的细胞群体，基于基因表达的GBM患者分层的临床意义和实用性仍在争论中。然而，深入了解GBM的转录特征可能有助于鉴定分子介体，这些分子介体不仅有助于增加对GBM发病机理的了解，而且还可以作为诊断，预后和/或预测性标志物纳入临床常规。

通常GBM的进展和复发通常伴随着向MES分子表型的转变。但对于从PN到MES过渡（PMT）的机制知之甚少。

--研究内容--

意大利San Raffaele科学研究院再生医学及干细胞和基因治疗科的科学家们研究发现：

ASCL1是PN GBM CSCs的特异性标记物

为了鉴定能预测GBM CSCs转录亚型的基因标记物，对患者衍生的GBM CSCs系：即L0605，L0306，L0627，L0104，L0512和L0125进行了转录组谱分析。并与几位患者的GBM组织样本的转录谱进行了比较。作为非干性对照，分析了标准的人类神经胶质瘤细胞系（GCL）：即U87，U373，T98G和LN18，以及血清培养的原代GBM系。结果显示，CSCss与GBM标本的基因表达谱图非常相似。

为了确定调节GBM分子亚组的分子介体，比较了CSCss和GCLs的全局基因表达谱。其中在CSCss中上调的基因列表中，选择了排名最高的前神经元亚组基因分类器ASCL1，并证实了它在CSCss及其异种移植物中的表达要高于GCL及其相应肿瘤中的表达。且在人的PN亚组中表达的增强。揭示ASCL1是CSCs特定的分子介体，可能在GBM亚组表型中发挥重要作用。

GBM CSCs中的过表达ASCL1促进神经胶质细胞向神经元分化

与GFP转导的模拟对照相比，CSCs系中的ASCL1过表达后，对其细胞的自我更新能力产生负面影响。且ASCL1过表达后，大多数CSCs中的增殖通路pERKThr202/Tyr204和pAKTSer473的激活被大大降低。在增生培养条件下（即存在EGF和FGF2的情况下），过表达ASCL1的CSCs仍会出现典型神经元样形态：即出现早期的Tuj1和晚期MAP2神经元标记物。同时GFAP-1R星形胶质细胞数量的减少，表明ASCL1的表达通过激活神经元分化并抑制神经胶质细胞而促进了CSCs中的谱系转换。

ASCL1抑制MES基因NDRG1的表达

通过研究发现，所有PN CSCs都表达ASCL1，而只有一些细胞表达NDRG1。而MES CSCs不表达ASCL1，却表达非常高水平的NDRG1。且实验表明NDRG1是MES的基因标记物，为了验证ASCL1是否可以直接调控NDRG1，通过利用NanoPro 1000检测发现，过表达ASCL1时，NDRG1及其磷酸化形式pNDRG1Thr346都大大降低。说明ASCL1抑制了NDRG1的表达。且后续实验证明ASCL1可以与NDRG1的启动子直接结合。说明ASCL1可以直接调控NDRG1，从而抑制PN GBM向MES表型转换的进程，为GBM提供了新的治疗机会。

Nanopro1000蛋白质翻译后修饰图谱分析技术，同时检测蛋白质表达极其翻译后修饰。

参考文献：

The proneural gene ASCL1 governs the transcriptional subgroup affiliation in glioblastoma stem cells by directly repressing the mesenchymal gene NDRG1, Cell Death Differ. 2019 Sep;26(9):1813-1831. 

Cancer stem cells in glioblastoma, Genes Dev. 2015 Jun 15;29(12):1203-17.