【经典文献赏析】微流成像颗粒分析技术（MFI）和光阻法（LO）对比研究

基于单克隆抗体（mAb）生产工艺的复杂性，因此需要对其关键质量属性(CQA)进行控制和监测，同时为了确保药物产品的安全性和有效性，还需证明CQA在生产过程的一致性。这些CQA包括可见颗粒（VPs）和亚可见（SVPs）颗粒的测量。然而过去并没有对治疗蛋白质产品中的亚可见颗粒（0.1-100μm）的颗粒进行积极的检测。有研究表明，治疗性蛋白质产品中的蛋白质有聚集并形成SVPs的倾向，且这种聚集会引起治疗效果的降低和潜在的免疫原性风险。欧洲药典(EP)2.9.19、美国药典(USP)<788>和中国药典(ChP)0903等药典专论中对SVPs进行颗粒计数限值。且USP<1787>建议使用4-100μm粒径范围内的形态测量，这可能有助于理解粒子来源为固有的、内在的/外在的，以降低SVPs带来的风险。

光阻法(LO)是USP<788>规定的主要检测方法，用于量化两个尺寸范围（≥10μm和≥25μm）的SVPs。该技术确定了颗粒的大小和数量，但由于其检测原理，无法区分不同类型的颗粒，例如蛋白质聚集体、硅油液滴等。许多研究表明，LO可能无法检测到半透明的蛋白质聚集体，从而低估了样品中的总颗粒。也有一些报告表明，样品的折射率(RI)会影响LO结果。

随着USP<787>和USP<1787>的发布，要求在计数/浓度和形态方面表征2-10μm的SVPs。流式成像显微镜(FIM)技术已成为量化与LO技术相同大小范围内的SVPs的替代方法，它可以检测半透明的蛋白质聚集体，即通过使用直接对颗粒进行成像的FIM，还可以获得形态信息。这使得该技术能够将蛋白质聚集体与其他颗粒（如硅油滴、气泡和其他外在和内在的颗粒杂质）区分开来。本文中FIM技术使用的是ProteinSimple的微流成像颗粒分析技术（MFI）。

到目前为止，比较这两种技术的研究都使用了标准微珠、蛋白质模拟物或有限数量的治疗性mAb样品。但没有对多批不同的商业治疗性mAb进行并排比较。在本研究中，使用LO和MFI方法分析了17种国家药品监督管理局批准的mAb药物产品。通过分析200多批mAb商业药物产品提供了一个独特的数据集，以检验MFI法和LO方法之间的粒子数计数差异和二者关联。

表1列出了17种生物制药mAb药物产品的清单。对于每种药物产品，最多可获得50个批次。不同批次的相同药物被视为研究中的不同样本。对于药物的不同批次，它们分别标有数字1、2、3等。因此，研究中共有205个样品，如表1所示。每个批次由LO和MFI测试3到9次。总共对205个样本使用两种方法进行了1266次测试（633次使用LO方法，633次使用MFI方法）。

如图所示，对使用MFI和LO测量的205个样品的颗粒计数进行了分析。由于颗粒形成是从较小尺寸到较大尺寸的动态过程，且USP<1787>要求对2-10μm颗粒进行表征（因为这个尺寸范围可能具有免疫原性）。所以使用MFI和LO检测了≥2μm、≥5μm、≥10μm的颗粒计数，以及2-10μm的颗粒计数。结果显示，在205个样本的633次运行中，22个样本的运行子集显示LO计数高于MFI计数。对于其余样本，MFI方法的计数高于LO方法。从结果中可以看出，来自注射器和冻干样品的样品在所有尺寸范围内的颗粒计数都明显高于瓶中液体。特别是在≥2μm尺寸范围内，根据之前的报告，硅油滴可能是这个尺寸范围内高计数的主要贡献者。2-10μm尺寸范围的计数与≥2μm尺寸范围的计数具有非常相似的趋势。这是因为粒子数的多少由较小的粒子数支配。冻干形式的药品在重构时可能会形成气泡，蛋白质容易吸附到气泡从而形成蛋白质颗粒。根据早期研究，MFI方法优于LO方法的一个优势是MFI比LO方法可以检测到更多的半透明蛋白质聚集体。因此，与LO方法相比，MFI方法通常检测到更多蛋白质溶液中的颗粒（如上图所示）。

为了验证MFI方法在检测半透明蛋白质聚集体方面优于LO，首先需要在MFI测试获得的结果中将蛋白质颗粒与其他颗粒分开。这可以通过利用MFI软件对粒子的各种尺寸、形态和图像强度信息等不同范围的参数来区分不同类型的粒子。利用参数的组合充当过滤器以分离样品中的蛋白质和其它颗粒。例如参数AR反映了粒子的圆度，AR=1表示正圆，AR<1表示非圆。通常，硅油滴和气泡的AR值接近1，而蛋白质颗粒的AR值较低。蛋白质颗粒图像通常具有相对较小的强度变化（暗度），而硅油滴、气泡和固体材料碎片通常具有明确的暗边缘。硅油滴、气泡或固体材料碎片的颗粒图像的强度变化（整个颗粒的暗度变化）大于蛋白质颗粒的强度变化。粒子图像的暗度变化可以通过参数Intensity STD来反映。因此可以采用AR<0.8或AR≥0.8且Intensity STD≤100的过滤器来区分样品中的蛋白质颗粒和其他污染物颗粒，例如硅油滴和固体材料的碎片。为了显示统计显著性，上图使用了三种粒子计数相对较高且MFI计数和LO计数之间差异较大的样本。

LO 和MFI检测了单个样品药物Atezolizumab的5个批次。结果显示，两个计数方法在所有运行中都相对一致，MFI的计数略高。对于药物 Daratumumab，如图B所示，在11个批次中，两个计数方法对于大多数运行来说都是一致的，其中一个批次的MFI计数要高得多。通过应用过滤器，可以确定MFI计数高的原因是蛋白质颗粒的计数高。从以上两个例子中可以看出，在同一种药物中，不同批次的颗粒计数MFI和LO方法的结果一般是一致的，MFI计数略高于LO计数。有几个批次具有较高的MFI计数，这是由于高计数的蛋白质颗粒引起的。不同批次的相同药物的蛋白质颗粒计数可能不同。

图C显示了来自注射器包装的两个Golimumab样品的计数。6次运行中的蛋白质颗粒计数是一致的，而非蛋白质颗粒的计数在不同批次中是可变的。大量MFI计数高于LO计数，主要原因是蛋白质颗粒计数高。这也证实了早期的研究。对于这种药物，在所有6次运行中，非蛋白质颗粒的趋势和LO的总计数非常吻合。

为了确定使用MFI观察到的更高计数是否与半透明蛋白质聚集体的数量有关。因为在示例中，从总MFI计数中分离出的非蛋白质颗粒计数接近LO计数。因此需要比较MFI的总计数与LO的计数以及MFI的计数与LO的非蛋白质部分之间的相关性。首先，将所有270次MFI运行中≥5μm的MFI计数与LO计数作图，相关性较低（图A）。当将MFI计数的非蛋白质颗粒与总LO计数作图时，相关性显著提高（R2从0.781到0.933），这表明蛋白质、半透明颗粒的数量是导致MFI计数高于LO的主要因素。因此证实了MFI在检测蛋白质半透明颗粒方面优于LO。

本研究使用LO和FIM方法测量了来自17种商业mAb药物产品的205个样品（批次）中≥2μm、≥5μm、2-10μm、≥10μm的SVPs。结果显示，冻干粉或注射器包装状态的样品显示出明显更高的颗粒浓度，尤其是在≥2μm尺寸范围内的颗粒计数。且MFI粒子计数通常高于LO计数（205个样本中的183个样本）。通过使用AR <0.8 or AR ≥0.8 and Intensity STD ≤100过滤器将样品中的蛋白质颗粒与其它污染物颗粒分离，审查了不同批次相同药物中LO和FIM计数的差异。MFI显示药物中的某些批次具有显著高的颗粒计数，被证实是由大量蛋白质颗粒引起的。同时，与瓶装液体相比，注射器的颗粒计数最多可高出10倍，瓶装液体主要归因于非蛋白质颗粒，主要是硅油液滴。MFI方法计数升高的原因是蛋白质、半透明颗粒而导致。将MFI的总计数与LO的总计数作图，并将MFI计数的非蛋白质部分也与LO的计数作图。结果相关性有很大改善。结果表明，与LO方法相比，蛋白质半透明颗粒的数量是MFI方法计数升高的主要因素。

以上表明，虽然LO方法是被广泛接受的微粒分析工具，但它不足以测量生物制药中的所有粒子，证明了MFI等正交工具的必要性。由于MFI的优势，可以开展实验室间验证研究，以测试将MFI技术引入mAb的释放控制和稳定性研究的可能性。因此目前药典对SVPs的要求可以通过MFI等新技术的应用进行优化。

获取资料请扫二维码