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Western Blot技术篇---样品制备

发布时间: 2020-07-06 15:01 来源:普诺森生物科技(上海)有限公司ProteinSimple

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Western Blot 是一种用于检测蛋白质以及蛋白质翻译后修饰的常用方法,可以对简单或复杂生物样品中的目标蛋白质进行半定量或定量分析。其操作步骤包括:

  • 从细胞、组织或体液中制备样品(蛋白质提取和蛋白质浓度测量)

  • 十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶通过电泳按大小分离蛋白质

  • 将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上

  • 封闭膜上的非特异性蛋白

  • 用特异性一抗探测靶蛋白

  • 与标记的化学发光或荧光分子偶联的二抗共孵育

  • 检测反映抗原/抗体结合的信号

  • 使用软件对目标蛋白条带进行光密度分析

westernblot步骤.png

Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中最常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程,因此任何一个步骤发生错误,都会导致最终的结果发生变异,从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明,Western Blot的一些关键步骤,例如样品制备方法、跑胶、转膜、抗体的选择以及定量所用的归一化方法,对于可再现的蛋白质印迹结果至关重要。

--样品制备--

Western blot步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备。有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。为了有效地提取蛋白质,应该选择一种合适的均质化方法,该方法可以通过细胞膜的破裂有效地释放细胞内的内容物。另外,应该选择最佳的裂解缓冲液以促进蛋白质的正确溶解并防止蛋白水解降解,从而获得大量的目标蛋白质。
从以下几个方面介绍:
样品制备的原则
蛋白样品的类型
蛋白样品制备的流程
组织或细胞破碎和裂解
破碎裂解的方法
裂解液一般组成

常见裂解液成份一览表
蛋白酶抑制剂的类型
常见的蛋白酶抑制剂一览表
参考文献

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.


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