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中医药与肠道菌群 | IF=8.57 Theranostics: 中药活性成分大黄酸治疗溃疡性结肠炎机制研究

发布时间: 2021-04-30 11:39 来源:上海中科新生命生物科技有限公司

编者按:肠道菌群是近年来中医药领域的研究热点,不仅与中医理论相契合,而且是中药口服发挥药效的重要靶点之一。基于肠道菌群的中药药理研究近年来也陆续刊登于核心期刊。

为了帮助广大研究者了解中医药相关肠道微生物的研究进展与方法,我们收集整理了近几年基于中药及肠靶轴研究的发表于GUT、Nature Communications、Theranostics等高水平期刊的论文。

【中医药与肠道菌群专辑】为大家精细解读重磅研究与进展。

Rhein modulates host purine metabolism in intestine through gut microbiota and ameliorates experimental colitis

【杂志名】:Theranostics

【影响因子】:IF=8.579

【中药单体】:单体大黄酸

【疾病】:溃疡性结肠炎

【样本类型】:小鼠动物模型

【技术方法】:16S +非靶代谢组

【关键菌群】:Lactobacillus sp

【是否菌群验证】:是

研究背景

【中药背景】大黄酸是大黄、芦荟、番泻叶等多种中药的主要成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗

氧化等多种药理作用。大黄酸可通过抑制巨噬细胞炎症小体的激活来减轻炎症,也可抑制IKKβ,减轻炎症血脑屏障。然而,大黄酸是否能改善结肠炎及其可能的机制仍不清楚。

【疾病与肠道菌群】 溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病,其病因学知之甚少,可能涉及免疫功能低下、遗传易感性和微生物失衡。迄今为止,尚未有有效的手段根治溃疡性结肠炎。近年来,研究者们发现肠道菌群在结肠炎的发生发展中扮演着重要的作用,炎症性肠病(IBD)患者出现黏液枯竭,紧密连接蛋白和微生物群转位表达下降。恢复肠道菌群稳态和肠道屏障功能可能是治疗UC或IBD的有效途径。嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌可以增强肠道屏障功能和降低炎症因子来改善结肠炎。因此,通过调控肠道微生物稳态从而缓解肠道炎症成为研究热点。

大黄酸的口服生物利用度较差,但仍然表现出明确的抗炎效果,因此肠道菌群可能是大黄酸作用的重要机理之一。南京中医药大学研究团队利用中药天然活性成分大黄酸治疗结肠炎症,将天然化合物的研究与肠道菌群-宿主代谢相结合,相关研究成果发表于权威期刊《Theranostics》。

实验设计

主要结论

1.大黄酸减轻葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠慢性结肠炎

采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠慢性结肠炎模型。在此基础上,100mg /kg大黄酸处理可减轻结肠缩短,50mg /kg和100mg /kg大黄酸处理组均减少免疫细胞浸润和组织损伤(图C-F),并逆转小鼠肠道炎症的敏感标记物粪便脂蛋白2 (LCN2)的表达(图G)。

高剂量大黄酸显著下调结肠IL-17、CXCL1、IFN-γ及IL-17 / IL-10比例,明显缓解炎症(图C-E)。此外,Th1/Th2细胞失衡也是结肠炎的一个重要指标,大黄酸使Th1细胞减少,对Th2细胞几乎无影响(图F-G)。

以上结果表明,大黄酸对DSS诱导的结肠炎有明显改善,且有剂量依赖性。

 2.大黄酸对粪便代谢物影响

肠道代谢谱改变是肠炎的最重要的特征之一。通过非靶向代谢组学确定小鼠肠道中改变的关键代谢物和代谢途径,。粪便中共鉴定出159种代谢物,3D-PCA分析显示DSS造模组与100 mg / kg大黄酸组之间存在差异,其中23种为差异表代谢物。通过代谢途径富集分析,聚焦到嘌呤代谢(图A-B)。正常条件下,参与嘌呤代谢的酶在细胞的合成和降解之间保持平衡的比例,一旦失衡会产生过多的尿酸。

进一步分析粪便中尿酸水平,发现DSS确实导致尿酸浓度显著增加,而大黄酸处理能够改善尿酸浓度(图D)。说明结肠炎期间嘌呤代谢途径发生了改变,大黄酸治疗改善嘌呤代谢异常从而降低肠道尿酸水平。

3.尿酸是影响肠道屏障的关键代谢物

1)体内研究

以往研究表明,高尿酸与多种疾病有关,且高尿酸可能破坏肠道屏障完整性。小鼠连续7天灌胃尿酸(1g/kg),虽然未引起明显炎症(有少量免疫细胞浸润)(图A),但肠道通透性增强(图B),紧密连接蛋白claudin-1和细胞粘附蛋白E-cadherin表达降低(图C),黏液层变薄,杯状细胞分泌的黏液蛋白-2减少(图C-D)。相反,大黄酸可恢复claudin-1、E-cadherin表达和粘液分泌。

2)体外细胞验证

进一步用人类正常结肠NCM-460细胞在体外测试:与体内一致,尿酸处理降低了claudin-1和E-cadherin的表达(图E);而尿酸处理加上100 mg/kg大黄酸处理,对DSS诱导的慢性结肠炎也表现出很强的保护作用,大黄酸可以消除尿酸引起的肠通透性增强。

4.大黄酸影响尿酸产生的机制研究

(1)大黄酸不能直接降低尿酸浓度

尿酸是嘌呤代谢途径终产物,黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH)是其中重要催化酶。但不同浓度大黄酸处理NCM-460细胞后,XDH表达没有差异,培养细胞上清液中的尿酸浓度也无显著变化。结果表明,大黄酸可能不是肠中嘌呤代谢的直接调节剂。

(2)大黄酸处理改变肠道菌群组成

大黄酸不能直接降低体内尿酸浓度,但可间接降低体内尿酸水平,而细菌拥有代谢尿酸的能力,并且部分细菌具有抑制黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH)的活性,因此推测肠道菌群可能是小鼠肠道尿酸减少的主要原因。16s 测序表明各组微生物群组成具有明显的差异特征(图A),LEfSe分析发现:与DSS组比,100 mg/kg大黄酸处理组的多种乳酸杆菌明显增加(图C),通过STAMP分析和定量PCR进一步证实大黄酸处理后乳酸菌丰度显著增加,且粪便中的乳酸浓度增加(图D-F)。

(3)菌群调节关键代谢物的机制研究

相关性分析显示乳酸杆菌的丰度与小鼠肠道的尿酸浓度呈负相关,这进一步表明乳酸杆菌在嘌呤代谢中可能具有关键作用(图A)。

为了获得进一步的证据,研究者进一步在体外培养了乳酸杆菌,与NCM-460细胞上清共培养24小时后。研究发现乳杆菌上清液可降低尿酸浓度,提示乳酸菌发酵产物的降尿酸作用(图B)。同时,大黄酸处理不改变乳酸杆菌中尿酸水平,表明尿酸不是由乳酸菌产生的,可能直接源于肠上皮细胞(图C)。因此,大黄酸的作用并不是直接影响肠道菌群对尿酸的代谢,而可能是通过改变乳酸杆菌的丰度,影响其发酵代谢物,进而间接影响肠上皮细胞的尿酸代谢过程。

研究者将100 mg/kg大黄素给药的小鼠的粪便微生物群移植到DSS小鼠体内,发现DSS诱导的小鼠结肠炎模型中尿酸减少(图D)。结果说明,大黄酸是通过改变肠道菌群组成并导致乳酸杆菌丰度增加,从而减少肠道上皮细胞中尿酸的产生。

5.FMT改善了DSS引起的结肠炎并恢复肠屏障功能

进一步研究发现,大黄酸给药的粪便移植(FMT)显著减轻了DSS诱导的结肠炎,降低结肠组织免疫细胞浸润(图A-E);E-cadherin和claudin-1表达增加,黏液层厚度恢复(图F-G),体内成像证实了FMT保护了肠漏(图H-I)。与DSS组比,FMT组乳酸杆菌水平上调。以上表明,FMT可改善DSS诱导的结肠炎和降低肠屏障通透性。

总结

本研究证实了大黄酸能够有效缓解DSS诱导的结肠炎症,通过非靶代谢发现大黄酸主要影响肠道嘌呤代谢,大黄酸降低肠道嘌呤代谢终产物尿酸的浓度。体内外实验证明了尿酸破坏肠道屏障功能,进一步通过16S测序发现肠道菌群结构在大黄酸给药后显著改变,大黄酸显著升高肠道内乳酸杆菌Lactobacillus的数量。体外实验证实了Lactobacillus sp能够有效降低肠道上皮细胞的尿酸水平。最后,采用粪菌移植证实了大黄酸对DSS诱导肠道炎症的治疗作用依赖于肠道菌群而发挥。

对于口服利用度较差的中药或中药成分,该研究提供的典型模式:从中药的药效活性出发,锁定引起疾病的关键代谢物,进一步解析关键代谢物产生异常机制——聚焦关键菌,最后通过粪便移植进一步验证药物通过改善关键菌发挥治疗效果。



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