【肿瘤分子分型】Cell：中国人群肺腺癌的全景分子图谱与预后标志物

编者按：

肿瘤分子分型：通过NGS、蛋白质组等组学技术，对肿瘤进行分子谱的系统描绘，并根据分子特征谱，进行肿瘤的精准分类及精准诊疗研究。

分子分型已成为国家精准医疗战略的重点研究投入方向；也备受CNS顶刊杂志青睐。

为了帮助广大临床研究者了解肿瘤分子分型及诊疗研究的重大前沿进展，我们收集整理了近几年来发表于Cell、Nature、Cancer Cell等顶刊上的，基于蛋白质组及蛋白基因组的肿瘤分子分型相关研究论文。

【肿瘤分子分型专辑】为大家精细解读重磅研究与进展。

【癌种】：肺癌

【细分癌种】：肺腺癌（LUAD）

【地域】：中国大陆

【通讯单位】：中国科学院上海药物研究所 新药研究国家重点实验室

【发表时间】：2020年

【涉及组学】：全外显子、转录组、蛋白组、磷酸化修饰蛋白组

【文献出处】：DOI:https://doi.org/10.1016 / j.cell.2020.05.043

主要成果

【流行病学】：肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症，5年期生存率低于20%。肺腺癌(LUAD)是非小细胞肺癌(NSCLC)中最常见的组织学亚型，约占肺恶性肿瘤的40%。LUAD最大的致病风险因素是吸烟，其他已报道风险因素主要有长期氡暴露、致癌物、空气污染等。近年来，非吸烟相关的LUAD患病率呈逐年上升趋势。遗传因素中，TP53、KRAS、KEAP1、STK11和EGFR等驱动基因是LUAD患者中最常见的体细胞突变类型。值得注意的是，亚洲地区非吸烟女性的LUAD患病人群中，EGFR突变比例可达40-50%。

【主要驱动基因】：TP53、KRAS、KEAP1、STK11、EGFR

【治疗方案】：LUAD的治疗选择包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫疗法或这些治疗的组合。针对靶向免疫检查点的几种驱动基因，以及免疫治疗的最新进展取得了显著的成功。针对EGFR和BRAF^V600E突变、ALK和ROS1重排的抑制剂，以及针对PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂抗体已被批准用于肺癌的精确治疗。但是，仍然有大量的LUAD没有可选择的治疗方案。此外，靶向治疗的耐药在LUAD病人中较为常见。

研究设计

【主要样本】：LUAD肺癌病人经手术切除的癌 VS 癌旁组织

【样本状态】：新鲜冰冻

【样本数量】：103 paired

【治疗干预】：手术前未经放化疗等干预

【主要研究路线与内容】：

1. 单组学分析：

组别： 癌 VS 癌旁

WES：基因拷贝数、基因突变

Label free蛋白组：蛋白鉴定与定量数量；蛋白组与mRNA相关性分析

Label free磷酸化蛋白组：修饰蛋白、修饰肽段鉴定与定量数量

2. 整合分析：

LUAD的多组学景观与蛋白基因组：

1.基因突变概况 

2.蛋白组与磷酸化蛋白组概况 

3.CNA的cis & trans调控 

4.基因突变的蛋白水平验证

LUAD组织的蛋白组表达特征：

1.癌VS癌旁组织的蛋白差异表达 

2.肿瘤相关蛋白与预后 

3.肺功能相关蛋白与预后 

4.早期LUAD的蛋白表达与预后 

5.驱动基因EGFR与TP53突变相关的蛋白表达特征

LUAD的分子分型与预后：

1.基于蛋白质组的分子分型 

2.亚型的预后 

3.亚型的组织分类 

4.亚型的基因突变特征 

5.亚型的蛋白表达与功能特征 

6.亚型的肺特有蛋白表达特征

LUAD的磷酸化蛋白组特征及临床意义：

1.癌 VS 癌旁组织的磷酸化差异表达 

2.激酶活性及亚型特征 

3.磷酸化水平与预后 

4.磷酸化信号调控网络

LUAD的预后生物标志物和药物靶点发现：

1.HSP90AB1作为预后标志物 

2.药靶注释与候选药靶

主要研究成果

一、LUAD样本的多组学景观

1. 多种学检测结果的统计。多组学分析包括103对癌和癌旁组织的外显子测序（WES）、51例癌组织和49例癌旁组织转录组测序、103对样本蛋白组、79对样本的磷酸化蛋白组分析，分析的总体情况见下表。

Overview of the experimental design and the number of samples for proteomics, phosphoproteomics, WES, and RNA-seq analyses.

2. WES分析基因突变情况。中国LUAD患者基因突变形式显著异于白种人患者。中国患者EGFR突变率高达50%，TCGA显示的白种人患者EGFR突变率为14%。中国患者KRAS突变率为6%，TCGA显示的白种人患者KRAS突变率达33%。其他突变基因包括TP53 (51%)、DCDC1(7%)、AFF2 (7%)等。

The genomic profiles. Top: mutation counts of the top 20 mutated genes in each patient. Bottom: the top 20 mutated genes and their occurrence in 103 patients.

3. 蛋白组和磷酸化蛋白组概况：在癌和癌旁样本中分别鉴定了11,091和10,793个蛋白，平均每个样本6,682个蛋白，其中丰度较高的蛋白有HBB、ACTB、HBA1等。共在5,277个蛋白中鉴定到22,564条磷酸化修饰肽段。

Overview of the proteomics and phosphoproteomics profile of LUAD patients.

结论：分析了中国人群LUAD基因突变、转录、蛋白和磷酸化修饰水平差异，鉴定了主要基因突变，中国LUAD患者基因突变形式显著异于白种人患者，表明不同种族之间的癌症基因组存在遗传多样性。

二、基因拷贝数变化（CNA）与mRNA/蛋白/磷酸化的表达关联

1. CNA的cis & trans调控：

(1) cis调控是指，A基因变化调控A基因的mRNA、蛋白与磷酸化；trans调控是指，A基因变化影响B基因等其他基因的mRNA、蛋白与磷酸化变化。如果基因突变或基因拷贝数的变化，与蛋白、磷酸化修饰的预期表达的不一致性，则可能导致基因指导的错误应用。

(2) 具有cis或trans调控作用的基因比例：CNA-mRNA（74.4%）、CNA-protein（45.6%）、CNA-磷酸化（18.8%），其中CNA对磷酸化水平的cis调控远低于另外两种类型。

(3) 基因拷贝数增加最常发生在7p、7q、1q、20q等染色体区域，基因缺失最常发生在13q、9p、9q和15q等染色体区域。在20个明确定义的LUAD驱动基因中，EGFR、RIT1、CDKN2A、STK11等四种CNA对mRNA表达具有显著的cis调控作用，其中仅EGFR表现出显著的CNA-protein和CNA-磷酸化cis调控。

Functional effects of CNAs on mRNA and proteins.

2. 基因突变的蛋白水平验证：

(1) 蛋白水平突变可以通过WES测序发现体细胞突变，转录组测序发现可变剪接和融合蛋白，再在蛋白组层面通过质谱的方式验证。

(2) 共发现13,845个单核苷酸变异 (8,630来自WES，6,544来自转录组)，1,365个插入和缺失突变，其中仅166个（1.2%）突变在蛋白组中出现。另外有0.32%的可变剪接突变和1.59%的新融合蛋白在蛋白组中得到验证。

B. Overlap of SNVs at DNA, mRNA, and protein levels.

C. Novel RNA splicing and fusion transcripts validated by LC-MS/MS.

结论：以上分析表明，转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组具有独特的特征。整合各组学结果发现，基因拷贝数变化与转录水平的相关性最高，其次为蛋白水平和磷酸化修饰水平，但整体相关性不高。多组学相结合能够发现更多新的突变带来的基因产物。

三、肿瘤组织的蛋白组表达特征

1. 整体表达情况：PCA分析显示癌和癌旁组织中的蛋白组特征存在明确的区别，表明在LUAD的发生发展过程中大量蛋白异常表达。

PCA of 8,252 proteins in 103 paired LUAD patients.

2. 癌VS癌旁组织的蛋白差异表达：共发现3,355个蛋白在癌和癌旁组织中差异表达，其中2,749个蛋白在癌组织中上调表达，606个蛋白下调表达。癌组织显著富集的通路包括蛋白酶体、糖酵解或糖异生、核糖体、泛素介导的蛋白水解、细胞周期等途径。而癌旁组织中富集的蛋白，主要参与肺生理功能相关通路(肺通气和免疫功能)。

Differentially expressed proteins in tumors and NATs and their associated biological pathways.

3. 肿瘤相关蛋白表达与预后：COL6A5、ITGA8、MYH10、MAGI1等蛋白在癌组织中低表达表征不良预后，这些蛋白与细胞基质粘附和细胞通讯有关。PSMD13、CUL2、CDK2、MCM6等蛋白在癌组织高表达，表征不良预后，这些蛋白参与蛋白稳态、细胞过程等。

Representative proteins from one of the four biological pathways and their association with prognosis.

4. 肺相关蛋白表达与预后（AGER、SFTPA2、CACNA2D2、LAMP3、SCGB1A1、SFTPB、SFTPC）：在肿瘤组织中低表达；当患者肿瘤中高表达某些肺富集的蛋白，如AGER、SFTPA2、CACNA2D2等，则可能会有更好的预后结果。

A list of lung signature proteins that were differentially expressed in tumors and NATs.

四、早期LUAD的蛋白组与预后

I期LUAD患者中不良预后组（DP组）和预后良好（DG组）两组间的差异：发现DG组富集的蛋白主要参与脂肪酸代谢、氧化磷酸化等途径，DP组富集的蛋白主要参与的上皮-间充质转化(EMT)以及其他炎症和致癌信号通路，如肿瘤坏死因子 (TNF-α)、mTOR、MYC等。MAOA、ACSS1、ANK1在DG组表达量更高，与良好预后正相关；THBS1、PLOD2、IGFBP3高表达表征不良预后。

A. GSEA (H, hallmark gene sets) of TNM stage I LUAD patients revealed pathways associated with a good or poor prognosis.

B. Proteins differentially expressed in the good or poor prognosis groups in stage I patients and their association with clinical outcomes in all patients.

五、驱动基因突变相关的蛋白表达特征

驱动基因EGFR和TP53的蛋白水平特征：一些致癌途径，包括DNA复制、错配修复和剪接体，在TP53突变的患者中发生了显著的变化。在EGFR突变患者癌组织中，LUAD的组织学染色标记蛋白TTF-1、NAPSA蛋白表达更高。在TP53突变患者癌组织中，NAPSA蛋白表达更低。EGFR和TP53双突变患者的生存预期更差。EGFR和TP53双突变患者较EGFR单突患者变化的蛋白中，氧化磷酸化、脂肪酸代谢和丙酸代谢途径下调，DNA复制、泛素介导的蛋白水解、蛋白酶体、错配修复和细胞周期等致癌途径上调。

Expression of two markers (TTF-1 and NAPSA) for LUAD pathological diagnosis in EGFR/TP53 mutant and wild-type LUADs.

结论：描绘了中国人群LUAD患者肿瘤组织中蛋白表达和通路富集特征；发现了一批能够标志患者预后的特征蛋白。

六、LUAD的分子分型与预后

1. 根据肿瘤蛋白组特征，将患者分为三个亚型：S-I定义为肿瘤微环境和新陈代谢型（EM-H），S-II定义为混合型，S-III定义为增殖和蛋白酶体型（PP）。

The relative abundance of 842 proteins in the three proteomic subtypes: S-I (environment and metabolism high [EM-H]), S-II (mixed), and S-III (proliferation and proteasome [PP]).

2. 亚型与预后：S-I亚型的临床预后最好，S-III亚型的临床预后最差，三个蛋白质组学亚型的TNM I期患者与生存率显著相关。

The association of three proteomic subtypes with clinical outcomes in 103 LUAD patients.

3. 亚型的组织分类特征：S-I分子亚型患者含有更多贴壁样腺癌（Lepidic）组织学亚型，S-III分子亚型患者的肿瘤分化程度较低，含有更高比例的实性腺癌（Solid）组织学亚型。

The association of proteomic subtypes with 11 variables.

4.  亚型的基因突变特征：（1）S-II亚型具有更高频率的EGFR突变，S-III亚型的整体突变负荷更高；（2）分析找到WES结果中9种突变特征与临床致病风险显著相关，包括年龄（signature 1）、吸烟（signature 4）、错配修复缺陷（signature 6）、黄曲霉毒素暴露（signature 24）、紫外照射（signature 7）等。突变特征signature 1在非吸烟患者和女性中最常见，且在S-III亚型中频率最低。

Distributions of nine main COSMIC signatures in the proteomic subtypes across 103 LUAD patients.

5.  亚型的蛋白功能特征：S-I亚型富集较多肿瘤微环境和能量代谢相关蛋白，参与ECM受体互作、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等，还有一些蛋白参与肺通气和免疫应答等肺细胞功能。S-III亚型更多地与蛋白质稳态和肿瘤增殖有关，例如核糖体、蛋白酶体、蛋白质分解、DNA复制、补体等相关蛋白。S-II亚型有兼于S-I和S-III亚型的特征。三种亚型在细胞粘附和细胞周期调控有各自的特征：一些参与肺细胞功能的蛋白在S-I亚型中高表达，但在S-III亚型中欠表达，这表明S-I亚型与正常组织更接近，而S-III具有更多的恶性特征。

E. GSEA (C2: curated gene sets, KEGG subset of canonical pathways) revealed the pathways that were significantly enriched in the proteomic subtypes.

F. Proteins in two pathways (focal adhesion and cell cycle) that were differentially expressed in the three proteomic subtypes.

6. 亚型的肺部特有蛋白表达特征：AGER、SFTPA2、CACNA2D2、LAMP3、SCGB1A1、SFTPB、SFTPC）在肿瘤组织中低表达。如患者肿瘤中高表达某些肺富集的蛋白，有更好的预后结果，如AGER、SFTPA2、CACNA2D2等。

Expression of MHC class I and II proteins (left) and proteins of complement-related pathways (right) in the three proteomic subtypes.

结论：以中国人群LUAD患者肿瘤组织中蛋白表达特征为基础划分为三个亚型，梳理了三个亚型与临床预后和组织学亚型的关联，分析了三个亚型的突变特征以及与临床致病风险的联系，揭示了三个亚型蛋白调控通路特征。总的来说，S-I亚型的蛋白表达特征更接近正常肺细胞，预后也最好，而S-III具有更多的恶性特征。

七、LUAD的磷酸化蛋白组特征及其临床意义

1. 癌 VS 癌旁组织的磷酸化差异表达：在50%以上患者中检出1, 244个磷酸化蛋白，其中474个磷酸化蛋白在肿瘤组织中显著上调，183个显著下调。

Expression of phosphoproteins in tumors or NATs.

2. 激酶激活与亚型特征：发现了多种在肿瘤中被激活的激酶，如CSNK2A1、MAPK、APK2、CDK1 CDK2、SGK1等。其中一些激酶在三个蛋白组亚型中被特异性激活，如S-I 亚型中的AKT1，S-II亚型中的PRKCE，S-III亚型中的AURKB、PRKCA、MAPK14等。

Evaluation of kinase activities by KSEA in tumors across the three proteomic subtypes.

3. 预后分析：差异表达的磷酸化蛋白中发现了与临床预后相关的蛋白，其中CTNNB1、SPTBN1和SNTB1的差异磷酸化在三个蛋白质组亚型中均与预后相关，这三个蛋白的低磷酸化患者具有更差的生存预期。蛋白组亚型S-I中参与细胞黏附的多个蛋白具有较高的磷酸化水平，而参与RNA转运的蛋白则显示较低的磷酸化水平。CAV2蛋白的S23位高磷酸化水平和EIF2S2的S2位低磷酸化水平与不良预后相关。

Identification of three differentially expressed phosphoproteins in tumors and NATs across the three proteomic subtypes (top panel) and the association of three phosphoproteins with OS.

A list of phosphosites involved in the two pathways and their abundance in the three proteomic subtypes and the association of two phosphosites with OS.

Phospho-regulatory network in LUAD.

结论：解析了LUAD的磷酸化蛋白质组学特征，找到了各蛋白组亚型中有代表性的调控激酶及亚型间磷酸化修饰差异，发现了能够表征临床预后的差异磷酸化修饰蛋白。

八、LUAD中潜在的预后生物标志物和药物靶点

利用严格的筛选标准，筛选出27个候选蛋白。

1. HSP90AB1预后标志物：

(1) HSP90AB1蛋白在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，HSP90AB1蛋白高表达与不良预后有关。

Protein expression of HSP 90b in tumors or NATs (p value from Wilcoxon signed-rank test) and associations with OS (p value from log-rank test).

(2) 为了证实HSP90AB1作为LUAD的预后性生物标志物的潜在价值，本研究使用ELISA在新的验证队列检测了705名LUAD患者和282名健康对照血浆中的HSP90AB1蛋白水平。结果证实在LUAD患者中HSP90AB1蛋白水平显著更高。

Measurement of the plasma protein level of HSP 90b in an independent cohort of 705 LUAD patients and 282 healthy individuals (p value from Wilcoxon rank-sum test).

(3) 分析499例LUAD患者的血浆中HSP90AB1蛋白水平与临床预后的关联，结果表明血浆中HSP90AB1与预后呈负相关。

Survival analyses of LUAD patients with high or low levels of plasma HSP 90b. Left panel, DFS; right panel, OS (p value from log rank test).

(4) HSP90AB1蛋白的抑制剂对LUAD细胞系的最大抑制浓度中值显著高于肺鳞癌细胞系，但低于小细胞肺癌细胞系。

Drug sensitivity of tanespimycin in LUAD, lung squamous cell carcinoma (LUSC), and small-cell lung cancer (SCLC) cell lines (from the GDSC database).

2.药靶注释与候选药靶：综合考虑蛋白的预后能力、癌和癌旁的差异表达、已有药物基础等特性，本研究筛选出CARS、IMPDH2、MCM2、GAPDH、GMPS、CTPS1等11个候选用药靶点，其中IMPDH2和GAPDH两个蛋白在肿瘤组织中高表达，且表达量可表征不良预后。IMPDH2和GAPDH是美国FDA已批准的药物靶点，可作为LUAD靶向治疗的新方向。

IMPDH2 (E) and GAPDH (F) as potential drug targets. Left panel: protein abundance in tumors and NATs. Center panel: CERES scores of IMPDH2 and GAPDH in 36 cell lines in the DepMap database (the black line illustrates the mean CERES score). Right panel: association of protein abundance with OS in 103 patients.

结论：HSP90AB1可作为LUAD诊断和预后的血浆生物标志物，IMPDH2和GAPDH蛋白可作为LUAD靶向治疗的新药靶。

总结

该研究使用103例中国LUAD患者的癌和癌旁组织进行了全面的多组学分析，通过蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、转录组和全外显子组测序数据，综合分析显示了LUAD相关的特征。从基因突变和拷贝数变异中发现了与肿瘤相关联的cis和trans调控，例如与EGFR和TP53等驱动基因突变相关联的调控。蛋白质组学分析确定了与患者临床和分子特征相关的三个亚型（S-I，S-II和S-III），每个亚型在存活率、遗传谱、肿瘤细胞代谢和调控网络等方面具有自身特点。从蛋白层面和磷酸化修饰层面找到了一批能够预后LUAD临床结局的分子，在独立队列中验证了HSP90AB蛋白作为血浆LUAD标志物的诊断和预后价值，并发现IMPDH2和GAPDH蛋白可作为LUAD靶向治疗的新药靶。该研究通过蛋白基因组研究全面地解析了LUAD的调控网络和分子特征，提高了对LUAD深层次的生物学理解，为LUAD更精确的诊断和治疗提供理论基础。