NAT METHODS | DIA技术再突破！微量大样本研究更灵敏，结果更稳定

精准医学时代到来推动了大样本研究飞速发展。数据非依赖采集（DIA）蛋白质组技术，因其无偏向采集样本中所有信息，带来DDA蛋白质组无法达到的高重复性、高稳定性、定量精确性，这些优势与大样本要求高度契合，使DIA成为当下大样本分析首选技术。

然而实际分析中，仍有一些其他困难和需求：1. 由于临床样本取样困难或极其珍贵，“如何实现更微量样本分析？”是许多研究者需求，这给DIA分析的灵敏度提出更高要求。2.由于大样本动辄百例甚至千例分析规模，“如何加速项目分析速度？”意味着不仅要确保数据稳定可靠，同时对DIA检测通量也提出了极大挑战。

2020年12月，来自马普所Matthias Mann、多伦多大学Hannes Röst、苏黎世联邦理工学院Ben C.Collins、Ruedi Aebersold等诸多领域顶尖科学家团队，在Nature Methods (IF=30.822) 发表“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition”文章，联合开发了基于离子淌度平台的DIA技术——diaPASEF，在保证当下DIA优势的同时，加持离子淌度分离，带来鉴定深度、微量样本检测灵敏度提升；此外，基于Evosep One高通量色谱搭配PASEF高速扫描方式，在鉴定能力及稳定性得到保证的同时，进一步实现大样本高通量分析。

dia-PASEF 原理

dia-PASEF蛋白质组，是在DIA技术上加持离子淌度（ion mobility）分离，它根据肽段离子形状属性不同，提供色谱、质谱分离外的新一维度分离，从而有效降低质谱解析复杂度，提升鉴定能力。基于timsTOF Pro质谱分析仪，搭载了双捕集离子淌度分析装置（TIMS），使肽段离子在两个TIMS中先后累积分离，并能同步运行，这种平行累积连续碎裂（PASEF）的工作方式，使离子利用率极高且扫描速度获10倍以上提升。

在dia-PASEF模式中，对于给定电荷肽段离子，由于离子淌度与质量具有相关性，故利用该特征设置DIA的母离子采集隔离窗口，不会丢失窗口外的离子信号。如下图，根据TIMS时间逐步调整的隔离窗口，2+、3+电荷下近乎大部分母离子均被采集到。

dia-PASEF 实现数据采集效率大幅提升

为了比较DDA、DIA、diaPASEF数据采集效果，分别采用简单、复杂样本进行了测试。对于简单样本，采用BSA酶解的肽段样本进行三种方法（45min梯度）比较分析，抽取DLGEEHFK碎片离子色谱图比较，结果表明，DDA分析中仅有<1%的离子束转换为碎片离子；传统DIA分析中虽能构建色谱峰形状，但也只<5%离子束转换为碎片离子；但在diaPASEF模式下，实现了近100%离子采集能力。对于复杂样本，采用HeLa细胞酶解肽段样本进行比较分析，从离子流结果分析，DDA模式中离子流强度最低、DIA模式比DDA离子流强度高3倍，而diaPASEF（4 scans）模式离子流强度又高出DIA达5倍。综上，diaPASEF在简单或复杂样本分析中均显著提高离子采集效率。

dia-PASEF 实现鉴定高深度与定量准确性

为了在典型DIA实验步骤下测试dia-PASEF 鉴定深度和覆盖度，采用Hela样本进行建库和样本分析。首先在24级分级基础上，构建了含9140种蛋白的DDA PASEF谱图库，随后对每个样本进行120分钟diaPASEF分析，结果表明3次重复实验共鉴定达7800个蛋白，每个样平均鉴定达7601个蛋白，且定量动态范围跨越四个数量级，表明了该技术极佳的鉴定深度。此外，3次重复实验中共同定量蛋白达7348个，相对于鉴定总数来说完整性高达94%，体现了极高的数据覆盖完整度。

为了确认在复杂混合样本中仍能实现定量准确性，将仅15ng酵母肽段样本掺入200 ng人源肽段样本（HeLa）中，进行3次重复检测。结果表明，尽管低丰度酵母掺入量仅占7％，但至少有两次重复鉴定到7697种人蛋白、1394种酵母蛋白，且蛋白质丰度比根据混合比例明显区分为两个不同的群体。人源蛋白在整个丰度范围内以1：1的比例聚集(σ(log2) = 0.22)，低丰度酵母掺入蛋白定量总体精度较低(σ(log2) = 0.70)。综上，diaPASEF能准确定量蛋白质丰度变化。

dia-PASEF实现微量样本的高灵敏度检测

为了进一步挑战微量样本检测灵敏度极限。首先，对diaPASEF扫描次数、四极杆隔离宽度等优化，保证微量样本中更高效的母离子肽段采集。结果表明，优化的diaPASEF实现了对低峰度肽段更好的检测效果，使肽段检测范围扩大约4倍。针对仅10 ng HeLa肽段样本的120min梯度分析，3次重复共定量蛋白质仍然能达4310个，且在至少2次重复中定量蛋白数达3909。综上，dia-PASEF能实现极低样本量的高灵敏度鉴定分析。

dia-PASEF+ Evosep One实现大样本高通量分析，带来检测速度提升

为了实现临床大样本的高通量分析需求，采用了具有快速周转时间Evosep One色谱系统，其最快能达每天200个样品分析速度；在质谱方面，对PASEF高速扫描模式进行采集速度参数优化，建立了不同检测通量的方法(每日60、100、200个样本)并进行测试。结果表明，每日60个样本通量（21min梯度）方法下，Hela样本三次重复共定量蛋白达5183，CV%中位数仅为5.8%, 即使通量增至每日100、200样本时，三次重复仍然定量到超过4000、3000个蛋白，CV%中位数低于10%。综上，dia-PASEF在大幅提升检测通量的同时，仍然能保证鉴定深度以及数据结果稳定性。

总结：

本研究建立了diaPASE工作流程，利用离子淌度与质荷比具有相关性原理，优化扫描参数，极大提升数据采集效率，确保深度鉴定、高灵敏度、高通量分析。在后续检测分析中，不仅证明了diaPASEF在微量样本中的极佳高灵敏度分析优势，而且证明了在大规模临床研究中强大的高通量分析能力。