肿瘤分子分型 | Cell：迄今最完整的小儿脑瘤跨组织分型与靶标发现

1. 7种小儿脑癌组织学类型共218个肿瘤样本蛋白质基因组学表征

2. 蛋白质组学揭示了不同组织学类型小儿脑癌的生物学特征

3. 蛋白质组学揭示了转录组学中不明显的DNA改变的下游效应

4. 激酶活性分析为通路活性和药物靶标提供见解

【流行病学】：小儿脑肿瘤是小儿癌症死亡主要原因。根据美国脑肿瘤登记中心（CBTRUS）的统计，在2012年至2016年期间，美国14岁以下小儿中，恶性中枢神经系统的发病率为5.74/10万，已经超过了小儿白血病的发病率，成为美国当时发病率最高，也是致死率最高的小儿癌症。在亚洲地区，日本的发病率估计为3.61/10万，中国台湾省的发病率为1.7/10万。

【诊断分类】：目前，小儿脑肿瘤的分类主要依照2007年及2016年世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类，其中，2007年WHO分类主要以组织学特征为依据，2016年又增加了分子特征为分型依据。常见的小儿脑肿瘤分类包括：胶质瘤、胚胎性肿瘤、生殖细胞肿瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤等。诱发原因包括电离辐射、遗传因素、病毒、化学物质等。诊断手段主要通过神经影像学检查，如磁共振成像（MRI）、CT来确定病变，通过组织学检查确定肿瘤类型。治疗手段以手术切除为主，放射、化学治疗为辅的综合治疗。

【主要驱动基因】：IDH1，BRAFV600E，CTNNB1

【主要样本】：低级别神经胶质瘤（LGG），室管膜瘤（EP），高级别神经胶质瘤（HGG），髓母细胞瘤（MB），神经节神经胶质瘤，颅咽管瘤（CP）和非典型畸胎样横纹肌瘤（ATRT）

【样本状态】：新鲜冰冻

【样本数量】：218份

【主要研究路线与内容】：

1. 单组学分析：

组别： 不同癌组

WES：基因拷贝数、基因突变；

TMT蛋白组 & MRM靶向蛋白组：蛋白鉴定与定量数量；蛋白组与mRNA相关性分析

TMT磷酸化蛋白组：修饰蛋白、修饰肽段鉴定与定量数量

2. 整合分析：

一、多种学检测结果的统计：

二、蛋白基因组分析与分子分型

1. 通过基于蛋白质组学数据的共识聚类分析，将小儿脑肿瘤分为8个亚型，分别为：Ependy（C1）, Medullo（C2）, Aggressive（C3）, Cranio/LGG-BRAF^V600E（C4）, HGG-rich（C5）, Ganglio-rich（C6）, LGG BRAF^WT-rich（C7）, and LGG BRAF^Fusion-rich（C8）。（1）这些亚型具有不同的生存结果、干性得分、增殖指数和信号通路活性；（2）多数分子亚型表现为组织类型的混合型；（3）基于蛋白质组和磷酸化数据可将颅咽管瘤（CP）分为两个亚群，转录组水平无此能力；（4）尸检样本的磷酸化修饰具有异常表现，不适合与活检样本进行蛋白修饰水平的整合分析。

2. 亚型的分子活性特征：相比于LGG BRAF^Fusion-rich（C8）样本，Cranio/LGG-BRAF^V600E（C4）表现出较高的MEK/ERK及AKT/mTOR相关激酶通路的活性。说明某些颅咽管瘤（CP）病人可能从MEK-mTOR联合抑制疗法中获益：

3. 为了验证上述结果：该研究进一步利用基于质谱的MRM靶向方法，对 MEK/ERK途径中的关键蛋白的表达情况进行了验证。证实了C4和C8亚型在MEK/ERK/AKT激酶通路的差异。同时也表明：MRM分析技术，具有肿瘤分型方面的临床应用可行性。

三、免疫浸润分析

1. 基于转录组数据的肿瘤微环境细胞丰度分析，确定了5组具有不同免疫和间质特征的肿瘤类型：Cold-medullo, Cold-mixed, Neuronal, Epithelial和Hot型。

2. 与蛋白质组分型结果比较：侵袭性越强的肿瘤在蛋白质亚型具有更低的免疫浸润性，如Aggressive, Medullo和Ependy型。而LGG BRAF^WT-rich, LGG BRAF^Fusion-rich, 和Cranio/LGG BRAF^V600E免疫浸润更高。

3. Hot型：属于LGG, HGG和ganglioglioma组织混合类。其包含多种类型的免疫细胞，包括巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞。与其他肿瘤相比，Hot型显示出包括上皮-间质转化（EMT）等相关免疫途径上调表达。此外，具有免疫抑制功能的腺苷的相关代谢，在此类亚型中上调，提示腺苷抑制类药物值得进一步探索。

4. Neuronal型：同样是LGG, HGG和ganglioglioma的混合组织型。其特征为谷氨酸受体通路、神经递质转运通路及细胞生长的激活。Neuronal型也表现出能量代谢途径的上调，如氧化磷酸化、线粒体蛋白复合物和糖酵解。提示如将谷氨酰胺拮抗剂作为“代谢免疫检查点”进行免疫治疗，这类亚型的病人可能获益。

5. Epithelial型：仅对应起源于上皮的CP瘤。其特征为EMT及CTLA4、PD-1分子表达上调。因此该亚型可从免疫检查点治疗获益，与之前报道一致。

6. Cold-medullo与Cold-mixed型：其特征为WNT信号，ß-catenin TCF complex装配, apoptosis和proteasome上调。该特征仅在蛋白与磷酸化水平呈现。

7. BRAF基因融合及突变与免疫特征：BRAF^Fusion和BRAF^V600E是LGG肿瘤重要致癌驱动因素，与多种免疫特征密切相关。值得注意的是，与野生型相比，BRAF^Fusion和BRAF^V600E肿瘤中的APM I类基因上调表达，BRAF^Fusion中M1巨噬细胞和M2小胶质细胞上调表达。BRAF^Fusion促进更多M2小胶质细胞，而BRAF^V600E促进更多M2巨噬细胞。

四、整合蛋白质基因组学揭示体细胞突变和拷贝数变异（CNV）对功能分子表达的影响

1. 体细胞突变对RNA/蛋白质水平的影响：（1）BRAF：与野生型 LGG肿瘤相比，具有BRAF^V600E突变的LGG肿瘤，BRAF蛋白丰度显著下调。（2）CTNNB1：突变导致CP样本中蛋白质/RNA水平升高；（3）NF1：突变导致HGG中蛋白和转录本下调表达。

2. 基因拷贝数在不同组织类别中，具有不同的cis调控效应：MB、HGG和EP肿瘤均显示出相对较高的基因组不稳定性。在这三种肿瘤中均观察到RABGAP1L，RAB3GAP2和FDPS的反复扩增，但仅在EP中观察到RABGAP1L扩增对其蛋白/磷酸蛋白显著影响；而FDPS的CNV / RNA /蛋白级联变化仅发生在HGG中。

3. 体细胞突变与CNV的trans调节：编码β-catenin的CTNNB1突变是CP样本中最主要的trans调控基因。CTNNB1突变与细胞间粘附相关的蛋白质/磷酸化以及WNT信号通路成员（如APC、GSK3A和GSK3B）上调表达有关。

五、基于磷酸化蛋白质组学的激酶活性分析

1. CDK1\CKD2：是参与细胞周期调控的蛋白依赖性激酶。其在ATRT、MB、HGG和EP等增殖性更强的肿瘤中活性增强。

2. CaMK2A：在HGG中，CaMK2A具有较高的蛋白表达和激酶活性；激酶-底物网络分析，发现CaMK2A与连接蛋白43（GJA1）与SYN的第568位和605位丝氨酸相关。说明CaMK2A可能在胶质瘤侵袭中有重要作用。

3. 从蛋白表达丰度的反向关系来看，CDK1/2和CaMK2A可能是两条独立的信号机制。

4. CDK5/GSK3B：CDK5/GSK3B在LGG中的Ganglio-rich亚型中上调。激酶-底物网络分析显示，CDK5/GSK3B与ADD2、SYN1、STMN1的磷酸化相关。这些结果与神经胶质瘤可通过创建神经元-神经胶质瘤突触，来劫持神经元发育的发现一致。

六、蛋白基因组解析低级别神经胶质瘤（LGG）的关键分子BRAF及药靶发现

BRAF是重要治疗靶点。对BRAF突变及基因融合的解析发现：与BRAF^WT肿瘤相比，BRAF^V600E和BRAF^Fusion肿瘤显示出常见的、改变类型特异性变化。

1. BRAF^V600E肿瘤中：丝裂原激活的蛋白激酶信号通路(MAPK; ERK)的蛋白丰度发生显著改变。

2. BRAF^V600E肿瘤中：AKT丝氨酸/苏氨酸激酶AKT1和AKT2的RNA /蛋白丰度，以及AKT1S1的RNA明显上调表达

3.  BRAF的磷酸化共表达网络：共表达网络分析发现2个在BRAF^V600E和BRAF^Fusion显示中显著上调的模块。模块1显著富集于MYC靶点和G2M检验点相关磷酸化位点。同时，模块1中显著富集的磷酸化位点受AKT2调控。

七、蛋白基因组解析高级别神经胶质瘤（HGG）的潜在预后标志物及药靶

1. 异柠檬酸脱氢酶（IDHs）与预后：IDHs被认为是astrocytomas, oligodendrogliomas及secondary glioblastomas的潜在胶质瘤治疗靶点，但在HGG中具有较低频的突变。另外，最近有研究指出IDHs可能在成年人群的黑色素瘤、胶质瘤和肾癌中具有诊疗意义，因此值得进一步关注。

（1）在H3^WT情况下：IDH全蛋白的表达均和患者总生存期（OS）改善正相关。虽然IDH全蛋白与OS改善有关，但IDH1与IDH2/3的表达无相关性，因而可能存在联合诊断的价值。联合IDH1和IDH2蛋白，通过建立多变量Cox回归模型分析显示，在H3^WT HGG患者中，当IDH1和IDH2的总丰度降低50％时，死亡风险增加23.58倍。通过对41个小儿HGG样本TMT蛋白质组学分析，确认了联合IDH1/2蛋白丰度表达降低与更短的OS相关。

八、原发性和复发性小儿脑瘤的比较分析

曾有报道发现同一病人的原发及复发肿瘤具有不同的表达模式。作者利用本研究中的18对样本的基因组和蛋白组数据，希望进一步回答：在治疗评估期，是否应将复发性肿瘤进行单独考虑：

1. 基因突变：复发组织具有0%–52% (平均18%) 的原发组织突变。值得注意的是，所有髓母细胞瘤（MB）进展期的样本都具有TP53突变，但在其原发组织中并未有此突变；此外，复发样本中的染色体臂畸变增加，断点数平均从32个增加到53个。

2. 蛋白质组：

（1）原发性和复发性肿瘤具有不同的蛋白质组模式，它们被归类为不同的蛋白质组亚型。

（2）原发性和复发性肿瘤在蛋白质组学水平的相关性并不高。

（3）原发性和复发性肿瘤具有不同的信号通路激活变化，因此药物治疗响应也可能有所不同。

该研究对7种不同组学类型（包括低级别神经胶质瘤（LGG），室管膜瘤（EP），高级别神经胶质瘤（HGG），髓母细胞瘤（MB），神经节神经胶质瘤，颅咽管瘤（CP）和非典型畸胎样横纹肌瘤（ATRT））共218份小儿脑肿瘤样本进行全基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组学表征，通过对蛋白质组学数据共识聚类分析，将小儿脑肿瘤分为8种亚型，它们具有不同的生存结果、干细胞分数、增殖指数和信号通路活性。免疫特征分析揭示了诊断过程中多种多样的肿瘤微环境。蛋白质组学数据还进一步揭示了在转录组学数据中不明显的体细胞突变和拷贝数变异的功能效应。激酶-底物关联和共表达网络分析揭示了重要的肿瘤发生的生物学机制。该研究是小儿脑肿瘤首个大规模的蛋白质基因组学分析，为揭示小儿脑肿瘤生物学特征以及为选择合理的治疗方案提供理论依据。