Molecular Cell：蛋白+磷酸化组学揭示首个人类肺部细胞感染新冠病毒后的分子反应图谱

新型冠状病毒（SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2）的人类传播是新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行的致病性病原体，给人类健康和社会经济都带来了巨大危机。目前研究发现该病毒会感染肺泡上皮2型细胞（AT2s），引起肺损伤和气体交换受损，但其感染和病理机制尚不清楚。

2020年12月17日，来自美国波士顿大学医学院的研究团队在CELL子刊Molecular Cell（IF 15.584）杂志上发表题目为"Actionable Cytopathogenic Host Responses of Human Alveolar Type 2 Cells to SARS-CoV-2"的研究成果，研究人员对感染SARS-CoV-2的iAT2s（诱导多能干细胞衍生的AT2s）进行了深入的定量时间磷酸化/蛋白质组分析，以定量分析在四个时间点（1、3、6、24 hpi）由iAT2s中SARS-CoV-2感染引起的细胞病理学变化，揭示宿主细胞信号传导和蛋白质表达谱，进一步将该工作与永生细胞系的先前研究进行了比较，系统级的预测病毒对肺细胞的影响以及哪些药物可以减慢感染速度。

研究材料：感染（实验组）和未感染（对照组）SARS-CoV-2的诱导多能干细胞衍生的肺泡上皮2型细胞（iAT2）；4个时间点：1、3、6、24 hpi。

技术方法：TMT蛋白组学和TMT磷酸化蛋白组学

实验方法简介：

步骤1：构建模型：肺部感染的病理生理模型；

步骤2：病毒感染iAT2s的定量时间质谱分析（蛋白组+磷酸化蛋白组）；

步骤3：宿主蛋白质组受到病毒感染的影响；

步骤4：分子支架解释肺细胞反应；

步骤5：磷酸化蛋白质组学揭示失调的途径；

步骤6：与SARS-CoV-2感染相关的功能网络；

步骤7：抗病毒药靶预测及验证；

步骤8：病毒感染后的分子反应图谱。

定量LC-MS/MS蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学工作流程示意图

研究结果：

1、构建模型：肺部感染的病理生理模型

通过定向分化从人多能干细胞（iPSC）系SPC2-ST-B2生成了iAT2，然后对表达tdTomato荧光报告基因的细胞进行分选，分离出纯度>95％的AT2样细胞。iAT2最初以3D肺泡球培养，然后播种在Transwell插入片段上产生ALI（空气-液体界面）培养物，以允许细胞从顶端表面感染。为了阐明受SARS-CoV-2影响的宿主系统，研究人员用新冠肺炎病毒感染iAT2 ALI培养物。免疫荧光分析（IFA）证实，感染后24 hpi的感染率约为20％。

肺部感染的病理生理模型构建

（上）3D肺泡和iAT2 ALI培养物的示意图；

（下）将iAT2 ALI培养物用SARS-CoV-2（MOI=5）感染并用平行模拟处理的对照进行指定时间感染。

2、病毒感染iAT2s的定量时间质谱分析

利用TMT定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组对感染后的iAT2s （4个时间点：1、3、6、24 hpi）进行检测分析，总共定量了8,471种蛋白质（包括8种病毒蛋白）和14,289个磷酸位点（位于2个病毒蛋白和2,703个宿主的磷酸化蛋白上），检测到2,872个显著蛋白（|log2 FC|>0.25，FDR<0.05），包括对表面活性剂功能至关重要的AT2标记，如SFTPA2。同时， 4,688个磷酸化位点发生改变（|log2 FC|>0.25，FDR<0.05），它们定位在1,166种独特的肺部蛋白上（许多与肺细胞功能的调节剂相对应，包括蛋白激酶、磷酸酶、衔接子和转录因子）。

蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学结果概述

3、宿主蛋白质组受到病毒感染的影响

为了表征初始iAT2宿主对感染的反应，研究人员对不同时间点（1-6 hpi）差异蛋白进行监督聚类发现了四个不同的Cluster，分别对应于接种（~1 hpi）、早期（~3 hpi）和中/晚期（3-6 hpi）宿主蛋白表达波动。Cluster 1与病毒进入（峰值~1 hpi）的快速反应相关，富含先前与病毒感染和免疫相关的因子，包括TRAF6介导的细胞因子诱导、NF-kB活化和C型凝集素受体的标记物。Cluster 2-4 （3–6 hpi） 富含与细胞增殖调节相关的蛋白质，包括检查点激酶调节剂ATR和细胞死亡效应因子CASP7/8的失调和有丝分裂检查点调节剂BUB1B，提示细胞周期停滞。

与该观察结果一致，免疫荧光染色实验揭示出SARS-CoV-2感染的iAT2s中PCNA表达明显降低，表明病毒诱导的间期阻滞。从感染的时间过程中出现了连贯的模式，反映出明显的功能富集。在24 hpi，检测到八个不同的病毒蛋白（S、M、N、Orf3a/7a/8/9b，以及映射到多蛋白Rep1a的多个成分）。在感染SARS-CoV-2的Caco-2细胞中发现了相同的病毒蛋白，表明Rep1a的结构蛋白表达丰富，并通过蛋白水解产生优先蛋白。

受感染的iAT2s中的宿主蛋白改变

（A）描绘1、3和6 hpi蛋白质丰度的簇；（B）功能富集分析；（C）火山图显示了在24 hpi时蛋白质丰度的差异；（D）IFA检测PCNA的表达。

4、分子支架解释肺细胞反应

SARS-CoV-2编码与宿主因子相互作用的蛋白酶、聚合酶和其他效应子。为了表征感染期间可能在iAT2中发生哪些的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用（PPI），研究人员将蛋白质组学时程数据叠加到了最近报道的SARS-CoV-2分子关联网络上，以此推断这些关联的动力学。在感染的iAT2中观察到了许多不同病毒效应子的假定宿主靶点的时间过程曲线存在显著差异。随着病毒复制的增加，在3-6 hpi时，很大一部分相互作用的肺蛋白受到了病毒的影响，这意味着其中一些变化是由病毒效应子结合引起的。病毒介导的不稳定可能破坏中心体-微管网络的重组，导致24 hpi所见的细胞周期停滞。相反，响应SARSCoV-2感染而上调的宿主蛋白更有可能与病毒效应子形成稳定的功能单元。

SARS-CoV-2病毒-宿主PPI网络

六边形：病毒效应子；正方形：iAT2靶点；颜色反映不同的簇。

5、磷酸化蛋白质组学揭示失调的途径

研究者针对病毒感染过程中磷酸化信号调控进行深入分析：分析24 hpi的病毒膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）上的磷酸化位点，发现核衣壳蛋白（N）上有9个独特的磷酸化位点被严重修饰，聚集在RNA结合（RBD）和二聚化结构域之间的连接区，而病毒膜蛋白（M）的C端细胞质结构域中的S213/S214被磷酸化修饰。进一步实验表明宿主激酶引起的病毒核衣壳蛋白（N）磷酸化可调节相分离，从而影响RNA组装和包装。利用差异宿主磷酸化蛋白的监督聚类和通路分析揭示iAT2细胞信号转导的整体变化，宿主激酶网络分析确定SARS-CoV-2影响iAT2s中的Ser/Thr/Tyr激酶。进一步分析并经实验证实，SARS-CoV-2具有重塑细胞的生长、感染重排宿主mRNA剪接、破坏核完整性的功能。

磷酸化蛋白质组学分析揭示了失调的途径

6、与SARS-CoV-2感染相关的功能网络

为了探索SARSCoV-2感染改变肺泡的途径和过程，对差异蛋白和磷酸化蛋白谱进行了富集分析，再将FDR<0.1的结果合并到基于共享组件的更高级别的模块中，发现代谢相关途径受到显著影响，包括脂肪酸代谢改变、线粒体呼吸作用和嘧啶核苷酸生物合成。这些结果表明宿主代谢发生重编程，有利于能量和生物质合成，以支持病毒复制。

时间分辨的宿主细胞对SARS-CoV-2感染的反应

7、抗病毒药靶预测及验证

为了探索本数据的治疗潜力，研究人员检测了不同的iAT2宿主磷酸化/蛋白质网络，以确定潜在的脆弱点，然后在每个时间点的病毒应答关联子网络中推断出可能的药靶。最终从7,000多种批准的药物中挑选了31种小分子抑制剂进行测试，只有KN-93（CAMK2的选择性抑制剂）和结核菌素在Vero E6和iAT2中均能有效抑制SARS-CoV-2复制。另外还有4种抑制剂（levofloxacin、FRAX486、losmapimod和AZ20）在iAT2s中有效抑制病毒复制，而在Vero E6细胞中显示无效或弱效（<10％抑制），其中对MAP激酶抑制剂losmapimod的研究还启动了一项针对COVID-19的3期临床试验。

基于网络的推理和药物测试

 小编小结：

SARS-CoV-2感染破坏了正常肺内稳态所需的分子过程，导致肺功能受损。阐明病毒在固有肺泡环境中劫持的细胞途径对于理解发病机制和设计治疗是至关重要的。为此，研究人员将人原代类AT2细胞与磷酸化/蛋白质组学时程分析相结合，证明了宿主对肺泡上皮细胞感染的不同反应。该方法绘制了早期感染、病毒颗粒形成前以及以显性病毒复制为特征的后期阶段的iAT2反应，表明随着病毒破坏宿主程序并重新连接模块，动态疾病特征会发生演变。该研究全面解析了新冠肺炎病毒感染机制，也为疾病治疗策略提供了新的见解。

肺泡2型细胞被SARS-CoV-2病毒感染后的分子反应图谱

上图：SARS-CoV-2引起的肺病理学；下图：病毒失调的iAT2通路、过程、蛋白质、磷酸化位点和已验证的药物/靶点。

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