Nat Med：多中心研究发现幼儿肠道菌群结构对儿童哮喘发病的重要影响

成人的许多疾病都源于生命的早期。调研发现，在农场长大有助于儿童哮喘保护，但这一现象背后的机制在很大程度上尚不清楚。微生物暴露与免疫性疾病(如过敏和哮喘)的反向关系提示高度多样化的微生物环境可能会影响人体微生物群，从而减轻哮喘风险。

2020年11月，德国慕尼黑赫姆霍兹中心哮喘与过敏预防研究所Martin Depner等在Nature medicine（IF 36.1）发表题为《Maturation of the gut microbiome during the first year of life contributes to the protective farm effect on childhood asthma》的一项多中心研究（奥地利、芬兰、德国、瑞士和法国）。揭示欧洲农村环境（家畜农场）出生长大的幼儿在第一年建立的肠道微生物群落对抵抗儿童哮喘具有十分重要的意义。

研究材料：出生后的第2月初和12月末的粪便样本

技术方法：16S rRNA测序+短链脂肪酸靶向代谢组

实验路线图：

研究结果：

1、研究队列人群和信息采集情况

在奥地利、芬兰、法国、德国和瑞士的农村地区招募了一组牧场出生的婴儿（一半出生家畜农场），在第2、12、54和72个月时进行家访，并在第2、12、18、24、36、48、60和72个月完成额外的问卷调查。通过每周日记和每月调查问卷，收集了关于儿童健康、营养和与农场有关接触的更多详细信息。在2个月和12个月家访期间收集粪便样本。环境因素的评估问卷覆盖怀孕和出生后的一年，包括是否早产、婴儿体重、分娩方式、抗生素使用情况、母乳喂养情况、饮食多样性敏感性分析、是否接触干草或动物棚、兄弟姐妹数量、宠物情况、怀孕期间吸烟和环境烟雾暴露情况、父母特异性病史及教育程度。

哮喘组指6岁前有一次及以上哮喘症状被诊断，健康对照组的定义是2-12个月期间无腹泻，任何时候均无哮喘症状。在2个月和12个月可用样本的儿童(n = 618)分布在各个中心(奥地利n=139; 瑞士n=205; 德国n=136; 芬兰n=138)，另外法国的102名儿童由于只有12月的样本，没有纳入其中。子样本根据哮喘状态分别用红色、蓝色和白色表示(是、否、不可用)。

研究队列情况

2、肠道菌群多样性分析

对618名儿童2月和12月的粪便样本16SrRNA测序结果分析显示，第2月的时候菌属以Bifidobacterium为主，第12月的时候Bifidobacterium减半，而Blautia的相对丰度大幅增加。通过Dirichlet混合建模对两个时间点的细菌组成数据进行聚类，确定了5个Dirichlet聚类(DCs)，其中DC1和DC2主要代表第2个月的样本，DC4和DC5代表第12个月的样本，DC3由两个时间点共享。DC1和DC2菌群较为单一，DC4和DC5菌群多样性更为丰富，DC3的样本间差异性较大。而在第12个月的样本中，DC3组儿童的哮喘患病率明显高于DC4和DC5组儿童。说明12月时肠道菌群的丰富度与儿童哮喘患病率相关。

第2月和第12月肠道菌群组成

3、菌群成熟度指标分析

为了更好地了解出生后第一年肠道微生物组的生理变化，作者通过随机森林分析第2月和12月时的粪便样本细菌属组成建立了精确的粪便采样年龄模型，模型结果预测得分称为EMA。为了排除疾病干扰，模型建立限制在133个健康个体(67个农场儿童和66个非农场儿童)，期间没有腹泻，也没有哮喘症状。预测模型中贡献最大的类群是Blautia和Coprococcus。当将预测模型应用到整个测试样本(n=618)时，在第2个月EMA属的组成没有明显变化，而在第12个月出现明确差异。在12个月时，患有任何形式哮喘的儿童平均EMA值明显较低，未完全成熟儿童的哮喘患病率为12%。同时EMA的影响在17q21染色体非风险基因型携带者中更为显著。说明EMA可作为衡量肠道菌群成熟程度的指标。

同时作者进行了真菌ITS测序（n=189）并与细菌数据一样建立EFA模型，但EFA和EMA没有相关性，不过2个月时Alternaria的相对丰度与随后的细菌成熟有关。

EMA与肠道菌群成熟度分析

4、EMA和农场环境因素对哮喘的影响

在618名儿童群体中，农场儿童哮喘风险也低于非农场儿童。在2个月时未观察到农场暴露对微生物组成的影响，而哮喘保护PCA轴3与母乳喂养呈正相关，与怀孕期间剖宫产和母亲吸烟呈负相关，与胎龄无关，但延长母乳喂养时间会延迟EMA。而在农场长大和特定农场接触对EMA有积极影响。12月时农场儿童会更高比例的分到DC4和DC5。结构方程模型显示，在农场长大的儿童中，EMA介导了19%的哮喘保护效应。第2个月的PCA轴3中母乳喂养对哮喘保护作用有18%的调节作用。在农场长大的儿童特征是更成熟的微生物群，其中Coprococcus 和Roseburia是已知的短链脂肪酸的制造者。

EMA和农场环境因素与哮喘的关系

5、细菌代谢物和EMA

为了评估细菌产生短链脂肪酸（SCFA）的能力，作者使用随机森林对209名儿童12个月时的粪便SCFA测量值和细菌属组成进行了建模，并根据菌群组成预测了其他样本中的SCFA水平。同时，作者对EMA和SCFA得分进行了四维PCA分析（n=720）。其中Butyrate（丁酸）和EMA在Dim1上有加载，Dim1与特应性和非特应性哮喘呈负相关；Acetate（乙酸）在Dim2上表现得尤为明显，但Dim2与哮喘无关；Dim3代表Propionate（丙酸）评分，部分代表EMA评分，与特应性哮喘呈负相关；Dim4主要反映EMA与Butyrate评分的差异，对非特应性哮喘有额外的保护作用。Dim1和Dim3(代表EMA、Butyrate和Propionate得分)与在农场长大呈正相关， Dim1调节了农场对哮喘15%的影响效应，Dim3调节了额外的6%。

同时，作者在巢式病例对照样本(44例患者和94例健康个体)中验证发现Butyrate评分是最重要的SCFA评分。通过qPCR测定了编码Butyrate代谢主要细菌酶（丁酰辅酶A:乙酸辅酶A-转移酶）的相对丰度。该基因检测结果与最初测量的Butyrate水平及预测的Butyrate评分进行比较时，发现在不同测量的最低四分位数中哮喘的比例特别高，且所有测量方法与哮喘表型的相关关系相似。说明SCFA尤其Butyrate对儿童哮喘保护具有重要作用。

细菌代谢物及EMA与哮喘的关系

6、细菌网络和过敏性分析

针对第12月时各属的微生物组成和相互关系，作者进行了网络分析。揭示了含3个hub的五个网络模块，两个中心分别为Roseburia和Ruminococcus，属于深绿色模块，其第一个特征向量与EMA (r = 0.73)和Butyrate评分(r=0.68)相关。黄色模块与EMA中度相关(r=0.35)，包含EMA的两个主要类群Blautia和Coprococcus。敏感性分析（Sensitivity Analysis）显示EMA也与3岁后的哮喘诊断呈负相关，特别是与较不常见的持续性哮鸣表型呈负相关(OR = 0.49，P < 0.001)。EMA与季节性、反复性或食物过敏原的致敏性无关。

单一类群分析网络图

小编小结：

本研究通过分析欧洲地区多个中心618名儿童在第2月和12月时的粪便菌群，建立了评判菌群成熟度的指标EMA评分。而12月时的EMA评分与6岁前是否患哮喘具有正相关，揭示了12月时的肠道菌群成熟度有助于农场儿童哮喘保护。短链脂肪酸合成相关的菌属及短链脂肪酸（Butyrate）介导了哮喘保护性农场效应，这也暗示了人体内肠-肺轴调控途径的存在。

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