Hepatology：蛋白组学揭示肝癌免疫逃逸新机制

肝细胞癌 (HCC) 是世界上最常见的人类恶性肿瘤之一，其中慢性肝脏炎症是最大的诱因。大量研究表明，持续炎症会引起肝细胞受损，如果受损细胞逃过免疫细胞的清除，则有可能进一步发生癌变。然而这种利于肿瘤发生的免疫抑制微环境是如何形成的，目前研究较少。

2020年10月，香港大学冯奕斌教授团队在Hepatology（IF 14.679）杂志上发表题目为 《LOXL4  Fosters  an  Immunosuppressive  Microenvironment  During Hepatocarcinogenesis》的研究成果，报道了LOXL4蛋白在促进肿瘤细胞免疫逃逸的独特作用，并通过Label free蛋白组发现了LOXL4在肝癌发生过程中促进免疫抑制微环境的分子机制。

研究材料：肝癌模型小鼠、骨髓来源的巨噬细胞、90对肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织

技术方法：Label free蛋白组

实验路线图：

研究结果：

1、通过小鼠肝癌模型发现关键蛋白LOXL4

赖氨酸氧化酶 (LOX) 家族的5个成员，即LOX和LOX-like (LOXL)蛋白1-4，是细胞外基质中铜依赖性的单胺氧化酶，催化胶原蛋白和弹性蛋白的交联。近年来的研究证实了LOX蛋白表达与肿瘤进展的相关性，但其在介导肝癌发生中的功能作用尚不清楚。

研究者首先采用CDAA饮食 （缺乏胆碱和氨基酸） 和CCl4处理建立小鼠肝脏肿瘤模型，小鼠在处理1-3个月出现脂肪变性病症，处理6个月发展为肝硬化，6-9个月进展为肝癌。分析发现，只有LOXL4的mRNA水平在肿瘤发生期显著升高，LOXL4蛋白也在病变肝组织中显著升高。有趣的是，肿瘤相关巨噬细胞中LOXL4蛋白免疫荧光信号较强，但在mRNA水平却并未检测到LOXL4的表达，作者推测，巨噬细胞可能通过外泌体吸收肿瘤细胞来源的LOXL4蛋白，WB杂交也证明了这一点。

肝癌发生阶段巨噬细胞积累高峰度LOXL4蛋白

2、LOXL4通过PD-L1塑造巨噬细胞免疫抑制来促进肿瘤进程

通过腺病毒条件敲低小鼠肝脏中LOXL4，与对照小鼠相比，LOXL4敲低小鼠每周肿瘤生长减慢，终点肝肿瘤体积和微血管密度降低。相反地，将rLOXL4（recombinant LOXL4 protein）腹腔注射到小鼠肝癌原位模型中，会导致肿瘤相关巨噬细胞中的LOXL4蛋白水平升高，并加速肝脏原位肿瘤生长。这表明LOXL4对肿瘤生长具有促进作用。但如果注射药物清除小鼠肝肿瘤的巨噬细胞，rLOXL4促进肿瘤生长的作用变得不显著，则说明LOXL4对肿瘤的促进作用有赖于其对巨噬细胞的调控作用。

LOXL4对巨噬细胞有怎样的影响呢？rLOXL4处理的巨噬细胞与CD8+ T细胞共培养显著降低T细胞增殖，且阻断了T细胞的激活，这证明LOXL4蛋白对巨噬细胞具有免疫抑制能力。因此，作者进一步分析了LOXL4对巨噬细胞的免疫检查点调控。结果表明，用rLOXL4处理巨噬细胞可显著提高了PD-L1 mRNA的表达，表明LOXL4激活了PD-L1的转录。使用中和抗体阻断rLOXL4处理的巨噬细胞中的PD-L1，可以恢复共培养T细胞的增殖和激活。体内实验也发现，rLOXL4处理降低了小鼠肝肿瘤中T细胞的数量，并削弱了T细胞的杀瘤作用。这些发现表明LOXL4对巨噬细胞的免疫抑制作用依赖于PD-L1途径。

LOXL4促肿瘤作用及对巨噬细胞的调控

3、蛋白组分析找到LOXL4调控免疫抑制的关键分子途径

为了探究LOXL4调控巨噬细胞中PD-L1表达的具体分子机制，研究者通过蛋白组学分析了巨噬细胞蛋白表达变化。Label free蛋白组筛选到大量差异蛋白，其中STAT1、STAT2、STAT3表达显著上调。STAT1-STAT3的异二聚体可作为转录因子促进含有IRE启动子元件的基因上调表达，而受此元件调控的基因大多具有免疫抑制作用。通过药物抑制STAT3或STAT1活性，可导致LOXL4处理的巨噬细胞中PD-L1的表达和转录激活降低。

此外，通过富集分析显示，与干扰素(IFNs)相关信号通路的基因受到LOXL4的正向调控。验证证实，巨噬细胞中大多数与IFN相关的基因都受到LOXL4的显著调控。通过中和抗体阻断IFN相关信号，降低了rLOXL4诱导的STAT3和STAT1激活。因此，rLOXL4诱导的PD-L1表达增加和转录激活也被IFNAR中和抗体削弱。

蛋白组分析及STAT蛋白功能验证

4、LOXL4的升高与HCC的不良预后相关

为了确定LOXL4与肝细胞癌的免疫状况和临床结局的关联，研究者比较了90例病人肝癌组织和癌旁组织的LOXL4蛋白表达情况，结果发现LOXL4蛋白表达在肿瘤中显著增加。在肝癌组织中，LOXL4蛋白表达阳性的细胞中约70%为CD68+型肿瘤相关巨噬细胞， 且LOXL4+CD68+细胞数量显著高于细胞数量LOXL4+CD68-细胞数量。分析发现CD68+型肿瘤相关巨噬细胞中的LOXL4蛋白表达量与PD-L1的水平正相关。评估LOXL4表达与患者生存期的相关性表明，LOXL4和PD-L1双低患者的总生存率高于双高患者。LOXL4高表达可能预示着肿瘤免疫抑制性微环境，这也将引发不良临床结局。

LOXL4表达量与肝癌患者预后

小编小结：

本研究围绕LOXL4在肝癌中的功能做了深入研究，首先通过表型分析确定了LOXL4的促肿瘤作用，随后证实其促肿瘤作用有赖于通过PD-1抑制巨噬细胞的免疫活性，进而利用蛋白组学发现了关键蛋白STATs，并通过实验证实LOXL4对巨噬细胞的免疫抑制功能主要依赖于IFN介导的STATs依赖性的PD-L1活化。临床检测发现肝癌CD68 +细胞中LOXL4蛋白表达量与PD-L1水平呈正相关，LOXL4的高表达和肿瘤组织中CD8A的低表达可共同预测HCC患者的不良生存。本研究揭示了LOXL4在肝癌发生过程中促进免疫抑制微环境形成的分子机理，也为肝癌防治提供了新的思路。

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