Mol Psychiatry：蛋白质组学解析自闭症和强迫症神经传递机制

自闭和强迫症等精神疾病与纹状体突触缺损有关，已有研究表明谷氨酸紊乱是引起该类行为异常的原因之一。星形细胞胱氨酸/谷氨酸逆转运系统xc- (包含2个亚基：xCT和4F2hc)是中枢神经系统胞外谷氨酸的重要来源，可以激活电离和代谢性谷氨酸受体，通过微调突触传递调节兴奋性信号。然而，该xc-系统对纹状体突触中神经传递功能的调节作用知之甚少。

2020年5月，布鲁塞尔自由大学神经科学中心研究团队在《Molecular Psychiatry》 (IF= 12.384)发表了研究成果，采用xCT敲除型小鼠模型，通过DDA蛋白质组学及DIA蛋白质组学方法研究证实xc-系统可调节皮质口神经传递，并对大脑回路调节的行为表型产生功能性影响 (包括重复行为以及社交能力)，该变化与突触前后谷氨酸浓度降低、突触前蛋白表达变化及激酶信号失调有关。

成年 (12-14周龄) 小鼠，雄性xCT敲除型 (xCT-/-) + 野生型 (xCT+/+)

切片电生理学 、DDA及DIA蛋白质组学、激酶组、免疫印迹等

1. xCT-/-小鼠皮质上皮神经传递减少

xCT-/-敲除型小鼠从9 V刺激电压开始，细胞外场兴奋性突触后电位 (fEPSPs) 显著降低。随刺激电压增加，2条输入/输出 (I/O) 曲线逐渐发散。而补加30 μM谷氨酸盐会导致切片中皮质上皮反应显著增加，并随电流刺激增加2条I/O曲线逐渐发散。

图1 xCT-/-降低皮质神经传递

2. xCT-/-小鼠脊柱、突触密度、背外侧纹状体的神经元形态、突触超微结构变化分析及皮质口突触中谷氨酸密度降低

xCT-/-小鼠与野生型小鼠相比，背外侧纹状体的中棘神经元 (MSN) 形态、MSNs分支片段上树突棘密度等形态学上均未发生显著变化。

图2 xCT-/-小鼠背外侧纹状体的树突棘密度及MSN形态

xCT-/-小鼠和xCT+/+小鼠在皮质口突触具有相似大小的突触后密度(PSD)。突出裂隙宽度、头部直径、树突棘区域、树突棘头部直径、线粒体区域、包含线粒体VGLUT1+末端比例以及穿孔PSD突触比例均无显著变化。xCT-/-小鼠不同突触区域的谷氨酸含量降低，包括VGLUT1+突触前末端、VGLUT1+末端接触的树突棘以及VGLUT1+突触前末端的线粒体。

图3 xCT-/-小鼠和xCT+/+小鼠皮质口突触的超微结构和谷氨酸密度变化

3. xCT-/-小鼠纹状体蛋白组学分析

通过基于DDA模式的shotgun蛋白质组学分析，结果发现xCT-/-小鼠纹状体大量突触前蛋白持续降低，突触后蛋白变化较小。对相同样本进行DIA蛋白质组学扫描分析及WB分析，结果与上述一致。

图4 xCT-/-小鼠与xCT+/+小鼠纹状体蛋白组学 (突触前蛋白和突触后蛋白) 分析

4. xCT-/-小鼠纹状体激酶变化分析

通过激酶富集分析，在xCT-/-小鼠与xCT+/+小鼠纹状体中共鉴定39种肽段在磷酸化水平上发生显著变化，以此作为输入底物，对其上游激酶进行进一步分析，发现14种不同的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族活性在两组间存在差异。通过构建激酶网络模型，确定STE7、ERK、蛋白激酶A和p38是xCT-/-小鼠纹状体中激酶网络失调的关键节点。FR 180204 (ERK1/2抑制剂) 对xCT-/-小鼠和xCT+/+小鼠激酶网络活性具有相反的作用效果：在xCT+/+小鼠中导致磷酸化水平普遍增加，而在xCT-/-小鼠中导致磷酸化水平普遍降低。

图5 xCT-/-小鼠与xCT+/+小鼠纹状体激酶信号网络分析

5. xCT-/-小鼠社交互动缺陷增加

在强迫症和自闭症中观察到的表型中存在重复社会交往中的行为缺陷，可能关联到皮质纹状体传递失调。为测试行为障碍，对xCT-/-小鼠进行大理石掩埋实验，评估xCT-/-小鼠挖掘的持久性和重复行为，结果发现xCT-/-小鼠大理石掩埋数量高、挖掘时间更长、挖洞总数增加，挖掘潜伏期无显著变化。在大理石掩埋测试中，发现xCT-/-小鼠的运动能力与xCT+/+小鼠无显著变化。社交互动测试结果证明，xCT-/-小鼠表现出社交能力下降，与年龄、性别等相匹配小鼠的社交时间减少。

图6 xCT-/-小鼠与xCT+/+小鼠大理石掩埋实验与社交行为评估分析

本研究利用切片电生理学以及xc-系统特定亚基基因缺失型小鼠发现皮质口突触神经传递减少，而补充细胞外谷氨酸可有效缓解上述影响，证明该缺陷与细胞外谷氨酸利用率降低有关。通过对xCT-/-小鼠纹状体蛋白组学和激酶分析以及运动学筛查，发现突触前蛋白表达量降低并且激酶信号通路异常，进一步证实xc-系统在调节皮质口神经传递方面具有重要作用。这篇文章从表型探究再到蛋白分子层面研究逐步深入，思路值得大家借鉴，其中蛋白质组学在其中起到连接宏观表型到微观变化的桥梁作用。

※ 前中科院上海生科院蛋白质研究分析中心，超过15年蛋白质组分析与服务积累，提供各类样本分析方案与实验设计方案。

※ 严格的质量控制体系，提供放心的数据。