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APT-Omics云课堂-DIA磷酸化讲座精彩回放
大数据时代到来，正逐步革新传统的生物、医学研究方式。蛋白磷酸化，作为深入理解生理、疾病调控的最重要修饰之一，也逐步进入高深度、大样本研究时代：磷酸化组高水平文章发表逐年增多、磷酸化谱构建工作纳入中国人类蛋白质组计划中。
7月16日，中科新生联合上海易算生物，带来《技术驱动创新：DIA助磷酸化步入高深度、大样本研究时代》讲座，分享了磷酸化新技术的发展、数据分析，以及DIA磷酸化修饰蛋白质组的优势及应用前景。借此，我们简单回顾一下讲座内容。
1 新技术驱动新发现：DIA助磷酸化研究步入高深度、大样本研究时代
中科新生命产品经理徐文佳博士，就磷酸化的发展现状做了归纳：磷酸化研究逐步从基于WB的hypothesis driven思路向基于组学的discovery driven方式变化，提示磷酸化研究正步入高通量深度分析、大样本研究时代。
然后，总结了现阶段磷酸化修饰组分析的难点，并分享了ASMS 2020最新前沿热点技术——“DIA磷酸化蛋白质组”的技术突破：基于IMAC高效富集磷酸化修饰肽段同时， 采用DIA扫描模式，有效解决磷酸化修饰的定性定量难题，实现低丰度修饰信息采集向“全息扫描”飞跃，并重点介绍其三大优势及中科新生命的数据测试结果：1）高覆盖度 2）高稳定性 3）高准确性。
最后，通过几个案例，展示了DIA磷酸化在以下研究方向中巨大的应用价值：信号网络机制解析、蛋白与磷酸化联合多组学整合、精准医学大队列样本研究。
2 磷酸化定量蛋白质组新进展及数据分析解析
问 题 解 答
Q DIA 比DDA有什么缺点吗？
从技术原理上来讲的话，无论是深度、稳定性、还是准确性，DIA均由于DDA。目前来说，DIA的缺点，或者说难点，主要在于DIA生成的谱图是非常复杂，解析难是问题之一，现在的分析软件及算法还可以进一步优化提升，后续将从原始数据中解析到更多的信息。
Q 富集的方法有推荐吗？
对于广谱磷酸化修饰组来说，富集介质可以采用IMAC、TIO2等，推荐采用商品化的IMAC富集， 富集稳定相对较好，适合DIA磷酸化大样本分析。
Q DIA建库也需要富集后的磷酸化肽段来进行吗，还是不需要？DIA磷酸化的话，打DIA的样品还需要做富集吗？前面展示的293T DIA 检测到一万七千多个磷酸化肽段，前期有做分级么？
DIA磷酸化修饰蛋白组，在建库阶段同样需要富集后的磷酸化肽段进行，且建库阶段可采取对富集磷酸化肽段分级的步骤，以进一步增加建库的库容。在样本检测阶段，DIA检测样本仍然需要富集后的磷酸化肽段进行DIA方式采集。我司293T DIA的测试结果，在建库阶段采用了DDA建库分级方法，DIA样本检测阶段并无分级。
Q 病毒感染过程多个时间点最多一个星期，如果时间点选择跨度一年，DIA可以吗？
可以，尤其对于大样本数量分析而言，往往样本采集跨度较长，DIA磷酸化更好的稳定性，使得很好满足跨度较长时间样本分析。
Q 如何保证DIA 数据的稳定性，或较低的CV值？
保证分析过程中样本稳定性；保证液相质谱系统稳定（色谱柱，温度，液相体系，质谱体系)。
Q 一个样本需要多少微克蛋白？DIA磷酸化和蛋白组学联合，总共需要多少蛋白量呢？
一个样本提取需要1mg蛋白，如果DIA磷酸化和蛋白组学联合，建议均DIA+DIA磷酸化，放在一起做的话，可需要DIA磷酸化的样本量即可。
Q DIA 做完之后，后续还需要进一步验证吗？
仍然需要进一步验证，推荐可采用基于的靶向PRM验证方法。
Q 您好，请问DIA 不用建立谱图库的方法可否再介绍一下。
directDIA，Inegrated database search engine called Pulsar enabling spectral-library free DIA workflow，来自于spectronaut查库软件开发公司Biogonosys算法，在spectronaut查库时，可基于DIA数据进行生成库，建立directDIA 的library。目前我们测试结果发现，相对于DDA建库后DIA分析，其相对鉴定结果还是更少一些，但该方法对于提升大样本分析速度、降低分析步骤成本来说，是极具潜力的分析流程。
Q DIA鉴定到的磷酸化肽段可以像DDA鉴定到的肽段一样手动提取出来，看碎裂后的b，y离子吗？如果可以提取，怎么看？如果不可以提取，怎么确定他的准确性？
DIA鉴定和DDA鉴定的肽段谱图都是可以提取出来查看详细的二级谱。例如下图是在分析结果中随机截取的一个磷酸化鉴定位点的二级谱及所有碎片离子的色谱图，我们可以清晰的看到该条肽段所采集到的所有的碎片离子，以及对应每个碎片离子的一个打分值，方便我们针对特定的位点进行后期的核验。
Q skyline和spectronaut在处理DIA数据时的差别是什么？skyline也是处理靶向PRM或DIA的数据。但是为什么很多文章是spectronaut？有什么主要的优势吗？
Spectronaut相较于Skyline来说性能更完备，算法更优化。举几个例子：首先Spectronaut可以支持谱图库的构建，并且主流仪器的数据类型基本都支持，Skyline无法支持谱图库构建，数据类型上也有限制；其次，Spectronaut可以进行directDIA的分析，Skyline不能；第三，Spectronaut引入Deep learning，进一步提高了数据校正的准确性及鉴定量，并且分析速度更快；第四，Spectronaut软件可以自动完成统计分析，并且可以同时整合MS1和MS2的定量结果协同进行差异检验分析，定量结果更精确。除此之外，还有很多的优势和功能，大家需要了解的话可以登录我们的官网（http://www.omicsolution.com/index.php/index/detail/id/56.html）进一步了解。
Q 请问标准化时，需要都用DIA吗？因为普通LFQ或者TMT做全蛋白的变化，他们的变化倍数可能跟DIA的磷酸化的变化倍数有所不同，所以在做标准化时，是否需要采取模式一定一样呢？
建议磷酸化蛋白质组和全蛋白质组采用统一的方法进行检测，尽可能保证鉴定的覆盖度和定量准确度保持一致，从而达到更优的结果。如果采用的方法不一致，也不是说完全不能做，只是准确度和精确度上肯定会差一些。
Q 经过富集后的磷酸化蛋白组如何归一化?
目前磷酸化蛋白质组进行归一化的常用方法是Median/Mean/total abundance 进行归一化，也是文献中大多采用的方法。默认的前提条件是待分析的样本间磷酸化的轮廓大部分一致。但是没有考虑到蛋白本底的变化，所以一般建议同时检测全蛋白质组，基于全蛋白质组的表达变化进行数据的标准化处理。
Q 你们可以检测多少种蛋白修饰类型？
中科新生命目前可提供多组类型的修饰蛋白质组服务，具体可参见以下服务列表：
| 标签： | 蛋白组 代谢组 多组学 中科新生命 DIA磷酸化 |