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中科项目文章 | 磷酸化蛋白组学揭示植物糖稳态调控新通路
CBL-CIPK通路（钙传感器类钙调磷酸酶B CBL与激酶CIPK相互作用）是钙信号转导的保守模式，其通过磷酸化不同的靶点参与了很多生长发育与逆境响应相关的生物学过程。糖是植物最重要的代谢产物，需要通过转运分配，维持体内糖稳态，因此糖转运过程需要精确的调控。尽管近年来发现了越来越多的CBL-CIPK通路的下游靶点，但CBL-CIPK与糖转运之间的关系却鲜有研究。
华中农业大学的研究团队于2020年3月份在《Plant Physiology》上发表了论文“The calcium sensor CBL2 and its interacting kinase CIPK6 are involved in plant sugar homeostasis via interacting with tonoplast sugar transporter TST2”。该研究运用磷酸化蛋白质组学等技术，表明 CBL2-CIPK6通路通过激活液泡膜糖转运蛋白TST2促进葡萄糖和果糖的积累。中科新生命有幸参与了磷酸化蛋白质组学分析工作。
Plant Physiology IF=7.4
实验材料
WT、RNAi干扰株系Ri16和过表达株系OE24的三叶期棉花幼苗
技术路线图
实验结果
1.挑选目标基因（GhCIPK6）并构建转基因植株
棉花是具有At和Dt亚基因组的异源四倍体，一共有79个GhCIPK基因。为了研究不同处理下棉花叶片中GhCIPK家族基因的表达水平，作者对68个RNA-seq数据库的相关数据进行了分析，结果表明来自At和Dt亚基组的同源基因GhCIPK6A3和GhCIPK6D3表达水平最高。棉花GhCIPK6A3/D3基因在本研究中被称作GhCIPK6，之前的研究报道表明该基因在多种非生物胁迫下差异表达，并且其表达水平具有昼夜节律。
为了研究GhCIPK6的功能，作者在棉花中建立了过表达和RNAi转基因株系，并且以野生型WT和Null植株（来自过表达转基因株系OE24，但是基因表达水平与WT基本一致的植株）作为对照，通过Southern杂交、RT-qPCR以及Northern杂交分析鉴定和检测转基因棉花中GhCIPK6的表达水平，筛选合适的株系进行后续研究。同时在拟南芥中也异源表达GhCIPK6基因，并采用RT-qPCR检测转基因拟南芥中该基因的表达水平。
图1 GhCIPK6基因的表达模式及转基因植株的分子鉴定
2. GhCIPK6正向调控糖积累和饥饿耐受性
研究人员在白天对不同时间点采集的棉花叶片进行糖含量测定，结果表明GhCIPK6过表达植株积累了约超过50倍的葡萄糖和3倍的果糖，但是蔗糖含量比WT降低50%。同时GhCIPK6 RNAi植株中，葡萄糖含量显著降低，而果糖和蔗糖的含量与WT相当。
为了探讨GhCIPK6在糖积累中的作用，对从种子萌发到第一叶完全膨大期的GhCIPK6转基因棉花的糖含量动态变化进行了测定。结果表明，过表达植株的子叶和叶片中的糖含量显著高于WT和RNAi干扰株系，而且可溶性糖含量在WT和RNAi株系中表现出明显的日变化节律。然而，过表达株系的糖含量仅在生长早期（萌发后第6天之前）出现振荡，然后逐渐增加，没有检测到节律。与棉花的结果一致，与WT相比，GhCIPK6异源高表达的拟南芥中可溶性糖和葡萄糖含量增加2-4倍。说明GhCIPK6在不同的物种中都具有调控糖积累的功能。
糖在植物的生存中起着重要作用，尤其是在没有光合作用的夜晚。为了研究GhCIPK6介导的糖含量增加是否提高了植物对长夜条件的耐受性，对WT和GhCIPK6过表达棉花进行了暗处理，结果表明过表达植株的存活率显著高于WT。类似的实验结果出现在WT和异源高表达的拟南芥中。这些结果说明在黑暗诱导的饥饿胁迫下，过表达GhCIPK6可以显著提高植物存活率，而且长期黑暗处理下OE24的离体叶片的含糖量高于WT，说明植物提高饥饿耐受性可能是由于细胞内糖的积累所致。
图2 GhCIPK6促进糖积累并增强抗饥饿能力
3.GhCBL2与GhCIPK6相互作用
CBL-CIPK通路在不同物种中是保守的，因此作者预测棉花中有一个或多个CBL会与GhCIPK6互作。利用BLAST以及系统发育树在棉花基因组中鉴定出12个GhCBLs。酵母双杂结果显示这12个蛋白中，有4个GhCBL蛋白与GhCIPK6相互作用。结合这4个基因在叶片中的表达水平，结果发现GhCBL2和GhCBL1A1基因高表达，因此选择这两个基因进行进一步的研究。体内和体外实验（Pull-down实验、荧光素酶互补成像技术LCI和双分子荧光互补技术BiFC）证明GhCBL2与GhCIPK6互作，且这一互作发生在液泡膜上，这暗示GhCBL2-GhCIPK6可能参与液泡糖转运的调节。
图3 体内和体外GhCBL2与GhCIPK6互作实验
4. GhCIPK6介导的糖积累依赖于GhCBL2
在WT和GhCIPK6过表达株系OE24中分别沉默GhCBL2和GhCBL1A1基因，OE24植株中GhCBL2的沉默导致糖含量显著降低，而OE24植物中GHCBL1A1的沉默对糖含量没有影响。这些结果表明GhCBL2是GhCIPK6介导的糖积累的一个正调节因子，而GhCBL1A1要么不参与这一途径，要么和其它的GhCBLs在这个功能上是冗余的。在WT和OE24中利用CRISPR技术突变GhCBL2基因，GhCBL2基因的突变不影响OE24中GhCIPK6的表达水平，OE24/GhCBL2突变体中可溶性糖和葡萄糖含量显著降低，但是仍高于WT/GhCBL2突变体，而GhCBL2过表达植株的可溶性糖和葡萄糖含量显著高于WT植株。以上结果表明，GhCBL2也能促进糖积累，且GhCIPK6介导的糖积累部分依赖于GhCBL2。
图4 GhCIPK6在糖积累中的作用依赖于GhCBL2
5. GhCIPK6与GhTST2互作
GhCIPK是激酶，下游的调控机制应该是通过磷酸化修饰进行调控。因此对WT、RNAi干扰以及过表达棉花叶片进行磷酸化蛋白质组的分析，结果鉴定到一系列GhCBL2-GhCIPK6的下游候选靶标。通过VIGS技术进一步筛选，最终鉴定到一个液泡膜定位的糖转运子GhTST2介导了GhCBL2-GhCIPK6所参与的糖积累功能。再通过体内及体外互作实验（Pull-down、LCI和BiFC实验）证实GhCIPK6可以与GhTST2在液泡膜上互作。
图5 液泡膜糖转运体GhTST2是GhCIPK6的靶标
6. GhCIPK6的糖积累依赖于GhTST2
为了进一步验证GhTST2的功能，在棉花中过表达了GhTST2基因。过表达GhTST2植株表现出与过表达GhCIPK6株系非常相近的表型，即与WT相比，GhTST2过表达植物中可的溶性糖和葡萄糖含量显著增加。且在GhCIPK6 过表达植株中突变GhTST2基因（即OE24/tst2突变体）能够显著下调可溶性糖和葡萄糖的含量，这表明GhCIPK6介导的糖积累依赖于GhTST2。
在异源表达GhCIPK6的拟南芥中敲除AtTST基因，得到的结果与棉花一致，说明CIPK6-TST1/2通路在不同物种中是保守的。
图6 GhCIPK6在糖积累中的作用依赖于GhTST2
7. 构建CBL2-CIPK6-TST2通路参与糖稳态的示意模型
基于以上结果，作者最后提出了GhCBL2-GhCIPK6-GhTST2参与液泡膜上葡萄糖转运的分子模型。
图7 CBL2-CIPK6-TST2通路参与糖稳态的示意模型
小结：
在这项研究中，作者发现一个来源于棉花的CIPK蛋白——GhCIPK6，在棉花和拟南芥中过表达GhCIPK6基因时，能够促进糖的积累，特别是葡萄糖。此外，作者还通过生化和遗传分析揭示了GhCIPK6能够与上游的钙传感器蛋白GhCBL2以及和下游液泡膜糖转运蛋白GhTST2互作。GhCIPK6被GhCBL2招募到液泡膜中，并促进GhTST2的Ser448磷酸化。该研究揭示了CBL2-CIPK6-TST2通路在葡萄糖转运中的保守功能。