Microbiome：代谢组学揭示宿主抵抗霍乱弧菌感染的机制

霍乱弧菌是流行性腹泻病、霍乱的病原体。虽然霍乱毒素（CT）和毒素调节菌毛（TCP）是已知的主要毒力决定因素，其致病机制是与本地微生物（统称为肠道微生物）相互作用的结果。肠道微生物的一个关键特征是其对肠道致病性感染的保护能力，称为“定植抗性”。最近的研究表明，共生微生物是抵御入侵病原体的屏障，肠道感染是共生菌、病原体和宿主肠道组织之间多层次相互作用的结果。然而，目前尚不清楚肠道微生物群的干扰（特别是通过物种和代谢物水平的变化）是如何影响宿主的感染抵抗力。

韩国延世大学医学院研究团队于2019年在《 Microbiome》上发表了论文 “Commensal-derived metabolites govern Vibrio cholerae pathogenesis in host intestine”。 通过解析CL引起的微生物菌群组成变化及其对宿主霍乱弧菌易感性的影响，揭示了共生代谢产物是宿主抵抗霍乱弧菌感染的关键决定因素。

IF=10.465

实验材料

16s rRNA：链霉素（SM）、万古霉素（VAN）和克林霉素（CL）三种不同抗生素分别治疗8周龄的成年C57BL/6特异性无病原体（SPF）小鼠。治疗5天后，收集小鼠粪便。

代谢组：SPF，SPF+Vc感染、SPF+CL处理，SPF+CL处理+Vc感染的小鼠盲肠内容物。

技术路线图

实验结果

1. 克林霉素处理的成年小鼠肠道菌群组成发生显著变化，对霍乱弧菌感染敏感

肠道病原体的定植取决于宿主肠道内固有微生物的组成。为了观察不同实验条件下肠道菌群组成变化对宿主感染抵抗力的影响，作者用链霉素（SM）、万古霉素（VAN）和克林霉素（CL）三种不同抗生素分别治疗成年C57BL/6特异性无病原体（SPF）小鼠（8周龄）。治疗5天后，收集小鼠粪便，通过16s rRNA基因测序分析微生物群组成，结果发现五个细菌门在各组之间具有特征性分布。

在未经治疗的对照组中，拟杆菌是最丰富的一个门，约占整个微生物种群的80%；VAN处理导致疣状结肠菌和蛋白细菌门的细菌细胞增殖；CL处理的结果，类杆菌门消灭，而硬壁菌门在数量上基本保持不变，而蛋白质细菌门丰度增加，进一步证明CL对抑制兼性厌氧菌的生长无效。

霍乱7号流行株N16961感染各抗生素组小鼠后，作者检测感染后小鼠肠道微生物群组成变化。在对照组和SM治疗组中，霍乱弧菌感染后，微生物群组成变化不大。在对N16961感染的反应中，VAN预处理后拟杆菌门的相对丰度增加。在CL处理的小鼠中，由于霍乱弧菌感染，厚壁菌门的相对丰度增加，而蛋白细菌门的相对丰度减少（图1h）。重要的是，在图1h中检测到的蛋白细菌门中， 约8.81%来自霍乱弧菌特异的16s rRNA基因序列。这一结果值得特别注意， 因为霍乱弧菌特异性序列在其他组的蛋白菌群中没有检测到（图1f，g）。

以上结果表明，霍乱弧菌可以在CL处理的条件下主动定植于成年小鼠的肠道。当霍乱弧菌感染成年小鼠的肠道菌群组成被CL处理改变时，它们会诱发类似霍乱的症状。

图1抗生素治疗后宿主对霍乱弧菌感染反应的微生物种群变化

2. 用CL处理小鼠的粪便移植无菌小鼠后，无菌小鼠易感染霍乱弧菌

CL诱导的肠道菌群组成变化与霍乱弧菌感染易感性升高有关，但之前的研究也表明，成年小鼠霍乱弧菌感染性增强可能归因于CL诱导的宿主免疫反应调节。为了解决这一问题，作者对无菌小鼠进行粪便移植（FMT），并检测粪便移植后无菌小鼠是否对霍乱弧菌感染产生不同的抵抗力。

经过3天的移植稳定期，霍乱弧菌感染无菌小鼠。结果用PBS处理的对照粪便移植无菌小鼠对感染产生了较强的抵抗力，而且没有从移植小鼠的小肠和盲肠中找到活的霍乱弧菌。而CL处理的粪便移植无菌小鼠中，盲肠和粪便中的霍乱弧菌定植率分别比对照组高出104倍和103.4倍（图2b）。霍乱弧菌定植期间，在CL处理的粪便移植无菌小鼠中，一种关键的毒力决定因子CT产量增加。以上结果表明，CL处理引起的肠道菌群组成的改变直接导致小鼠宿主更易感染霍乱弧菌。

图2 用CL处理过的小鼠粪便移植的无菌小鼠易感染霍乱弧菌

3. Bacteroides vulgatus 是拟杆菌门的优势种

根图1结果，CL预处理小鼠中霍乱弧菌感染的升高可归因于拟杆菌的减少或蛋白质细菌门的增加。同时也注意到：蛋白质细菌群体同样在VAN处理的小鼠中充分繁殖，这组小鼠没有出现霍乱样症状（图1c）。其次，感染前的拟杆菌门相对丰度从38%增加到感染后的61%（图1c，g）。基于这些结果，作者推测拟杆菌门主要占据成年小鼠肠道，在保护宿主免受霍乱弧菌感染方面起着关键作用。

为了深入了解拟杆菌门的菌种组成，作者使用16s rRNA测序进行了菌种分析。确定了三种不同的细菌属于拟杆菌门： Bacteroides vulgatus 、 Parabacteroides goldsteinii 和 Bacteroides caccae 。在对照小鼠中， B. vulgatus 数量最多，相对丰度大于整个种群的50%（图3.1）。VAN处理后， P.goldsteinii 繁殖，而 B.vulgatus 的种群数量减少。但在霍乱弧菌感染后， B.vulgatus 的相对丰度恢复到原来的水平。在霍乱弧菌感染之前或之后，经CL处理的小鼠排出的粪便中均未检测到与这三种细菌的16s rRNA基因序列。

图3 抗生素治疗和霍乱弧菌感染后微生物菌种的丰度变化

4. B. vulgatus 抑制体内霍乱弧菌生长

由于 B. vulgatus 是成年小鼠肠道中最主要的优势种，接下来作者在更明确的条件下检测 B. vulgatus 改变宿主对霍乱弧菌易感性的影响。在感染霍乱弧菌之前，用体外厌氧培养的 B. vulgatus 悬浮液处理无菌小鼠（live-Bv组），并用热杀死的 B.vulgatus 作为额外的阴性对照（HK-Bv组）。感染后24小时后，与PBS和HK-Bv对照组相比，live-Bv组中小肠、结肠和粪便中的霍乱弧菌定植显著减少。而HK-Bv组中的霍乱弧菌定植数目从未减少。这些结果表明，活跃的 B. vulgatus 存在于成年小鼠肠道中时，可以抑制霍乱弧菌的定植。

接下来，作者探讨了 B.vulgatus 是否也有效地抑制了用于研究霍乱弧菌感染的幼鼠模型中的霍乱弧菌定植。实验结果表明， B.vulgatus 移植到幼年小鼠肠内时，也能有效抑制霍乱弧菌的定植，且 B.vulgatus 移植幼鼠感染引起的积液显著减少。以上结果表明 B. vulgatus 抑制体内霍乱弧菌生长。

图4 B. vulgatus抑制体内霍乱弧菌生长

5. 代谢谱图显示直接调节肠道霍乱弧菌生长的特征性代谢物

作者接下来进行了代谢组分析，以检查代谢物分布是否因CL治疗或霍乱弧菌感染而改变。结果一共鉴定到273种代谢物，对这些代谢物进行层次聚类分析，用热图显示代谢物在四组样本间的相对表达量。层次聚类结果表明CL处理比霍乱弧菌处理诱导更多的代谢物表达水平的变化；而CL诱导的代谢产物水平的变化可能创造了一个强烈促进霍乱弧菌生长和发病的环境。

图5.1 盲肠代谢产物的层次聚类分析

表1列出了在对照SPF（化合物1~13）或CL处理（化合物14~27）小鼠中检测到的最大数量的代谢物。在SPF小鼠盲肠中检测到的13种分子中，除胆酸外，其余均未在CL处理小鼠中检测到，且短链脂肪酸（SCFA）是对照组中检测最丰富的代谢物。14种化合物（14~27）被选为CL处理组的主要代谢物。在对照组中，这14个分子的相对数量要么是不可检测的（化合物14、21、23和27），要么是相当小的。这些结果进一步证实了CL处理后小鼠肠道微生物的代谢谱发生了明显的变化。

表1 SPF和CL处理小鼠肠道中占优势的代谢产物及其对霍乱弧菌生长的影响

作者接下来研究了这些主要化合物是如何控制霍乱弧菌生长的。在列出的27种化合物中，有效性筛选出来17种化学物进行功能验证。作者监测了霍乱弧菌在M9培养基中的体外生长情况，生长曲线实验揭示了能够抑制和刺激霍乱弧菌生长的化合物。7种代谢产物（胆酸、丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸、异戊酸和三甲胺）对霍乱弧菌生长有明显抑制作用，且这些化合物在正常SPF小鼠肠道中的含量最大，但在CL处理的小鼠肠道中不存在或几乎检测不到。当培养基中含有NAG时，观察到对霍乱弧菌的生长具有显著促进作用，与NAG相比，葡萄糖酸和葡萄糖酸内酯对霍乱弧菌的生长也有促进作用。且与SPF对照组小鼠相比，CL处理小鼠体内检测到的这些代谢物更为丰富。

总之，以上结果表明，CL诱导的宿主肠道变化明显反映在代谢物水平的改变上，这种代谢谱的主要变化显著影响霍乱弧菌的肠道生长。

图5.2 抑制体外霍乱弧菌生长的几种代谢物

图5.3 促进体外霍乱弧菌生长的几种代谢物

6. CL处理成年小鼠可作为研究霍乱弧菌发病机制的模型

为了研究CL处理的小鼠是否可以作为描述霍乱弧菌感染的模型，作者用N16961及其 ΔtcpA 突变体（在肠道定植方面有缺陷的特征性霍乱弧菌突变体）的1:1混合物感染了小鼠，通过竞争指数的计算比较了这两个菌株的定殖能力。实验结果表明CL处理的小鼠的体液积聚和细菌定植再次显著增加，而PBS处理的对照组则没有。CL处理小鼠小肠和盲肠的竞争指数（ΔtcpA/WT）的平均值分别为~0.29和~0.28，说明与WT N16961相比， ΔtcpA 突变体表现出显著降低的定殖能力。相比之下，当使用未经治疗的成年小鼠时，两种菌株之间的定殖能力没有显著差异。

以上结果表明，CL预处理不仅可以诱导细菌的活性定植，而且可以使我们更好地了解霍乱弧菌的发病机制。

图6 霍乱弧菌ΔtcpA突变株在CL处理成年小鼠肠道定植中存在缺陷

7. CL引起的微生物群组成变化及其对宿主霍乱弧菌易感性的影响

基于以上结果，作者最后构建了CL引起的微生物群组成变化及其对宿主霍乱弧菌易感性影响的分子模型。

图7 CL引起的微生物群组成变化及其对宿主霍乱弧菌易感性的影响

小结：

本文说明了小鼠肠道中拟杆菌门的优势种 Bacteroides vulgatus 如何抑制霍乱弧菌（一种病原体）的感染。克林霉素（Clindamycin，CL）是一种选择性地杀死厌氧菌的抗生素，因此拟杆菌可以从CL处理过的小鼠肠道中完全根除。拟杆菌缺失的成年小鼠感染霍乱弧菌后出现严重的霍乱症状。无菌小鼠中定植 Bacteroides vulgatus 对霍乱弧菌感染具有抵抗力。经CL处理后，霍乱弧菌生长抑制代谢物（包括短链脂肪酸）的水平下降，而促进霍乱弧菌增殖的化合物水平升高。说明 共生代谢产物是宿主抵抗霍乱弧菌感染的关键决定因素，而对成年小鼠进行CL预处理可产生一个简单而有用的霍乱感染模型。