化废为宝！整合宏组学揭示：有氧堆肥降低抗生素抗性基因累积

畜禽粪便是抗生素抗性基因(ARGs)向环境传播的重要来源，对公众健康构成直接威胁。虽然重复利用粪肥对土壤微生物群落和ARGs的影响已被广泛研究，但对不同管理方法产生的微生物群落和ARGs的综合特征还不是很清楚。

山东大学课题组在“ Journal of Hazardous Materials”发表了论文“Aerobic composting as an effective cow manure management strategy for reducing the dissemination of antibiotic resistance genes: An integrated meta-omics study“。该研究分析了三种传统管理策略：好氧堆肥、机械干燥和沉淀， 并应用16s rRNA测序，宏基因组学和宏蛋白质组学相结合的整合组学方法分析牛粪肥中微生物群落和ARGs的累积，最终发现好氧堆肥方式可更好的控制ARGs的传播。

IF=7.65

研究材料

机械干燥过程/好氧堆肥/沉淀，牛粪

研究路线

研究结果

1. 细菌群落特征

对微生物多样性（OTU）进行分析，发现沉降样本中最高，堆肥中最低。根据非度量多维标度分析（NMDS），发现随粪便处理方法不同，微生物群落得到很好的聚类。Bray Curtis相似分析还表明，三组微生物群落具有异质性。总之，1993个OTUs在三组中共同包含，在沉淀处理样本中发现独特OTUs最多（1003个）。

图1. 总体细菌群落多样性分析

2. 细菌群落组成

共鉴定出50个门，优势门为厚壁菌门(35.31%)、拟杆菌门(17.95%)、热球菌门(13.29%)、变形杆菌门(12.92%)和放线菌门(6.18%)，占120个样品中鉴定序列的52.04%-99.73%。另外，不同菌门在不同粪肥处理方式中的累积也不同，如厚壁菌门在机械干燥和有氧堆肥中占主导地位，而拟杆菌门在沉降样本中比较丰富。

图2. 三种处理方式 “ 门 ”水平细菌群落组成

在属的水平上，三组样本细菌群落的组成也存在显著差异。例如，以需氧堆肥组为例，有氧堆肥组的栖热菌属数量最多，相对丰度为21.65% (Spr6组为70.37%)，是沉淀和机械干燥组的100多倍。

图3. 30个最丰富细菌属在粪肥中分布热图

3. 粪便样本的宏基因组分析

从三种不同处理粪便样本中获取10个宏基因组进行测序，每个样本79.3-89.8百万读长。如图所示，耐四环素、多药、磺胺、氨基糖苷和-内酰胺的基因占主导地位，占所有耐药基因的90%，同时， 随着堆肥时间延长，ARG基因的数量降低。通过处理方法将检测到的堆肥宏基因组中的ARGs聚类，堆肥样品得到很好的聚类。

图4. 粪肥中ARGs分布模式

4. ARGs的组成和丰度分析

宏基因组数据显示，堆肥14天后，ARGs基因的数量急剧降低。然后，通过qPCR方法验证ARG基因动态变化。总的来说，在针对7种抗生素类型的49种ARGs中，有22种被检测到，其中9种ARGs在三个季节中都存在，占堆肥样品中检测到的全部ARGs的66.6% - 99.5%。另外，冬季和春季堆肥产生类似的ARG组成，与夏季不同。1-2个季节中产生的13个基因，大部分在夏季中能检测到，其中9个只在夏季中检测到，一般随时间呈丰度上升-下降趋势。cat和acrA基因在冬季和春季均有大量的下降趋势。基因aph和blaPSE分别在冬季和春季第0天低水平检测。

图5. 冬季、春季、夏季有氧堆肥中ARGs分布

5. 优势菌群的宏蛋白组分析

为了阐明关键的功能微生物群落，利用 LC-MS/MS方法获得了机械干燥样品和堆肥样品的宏蛋白组数据。从机械干燥和堆肥样品构建的15个和33个宏蛋白组中，分别鉴定出1315个和2040个蛋白质。只有 476个蛋白在两组间共享，这表明了两者之间蛋白组成不同。在宏基因组中相对丰度较高的微生物也占主导地位。例如，不动杆菌属不仅主导了BED和IBE微生物群落的组成，而且在这些样品的微生物群落功能中也发挥了重要作用，其蛋白质丰度在50.9%到74.4%之间。然而，在堆肥样品中，主导性为栖热菌属和海洋红嗜热盐菌所替代。堆肥中第14天，冬天和夏天分别有将近75%和60%的蛋白有这两种菌属分泌。

图6. 有氧堆肥和机械干燥样本中主导功能菌属的宏蛋白质组成

6. 堆肥ARGs和微生物群落之间关系分析

检测到的ARGs与堆肥过程中的主要微生物之间存在相关性。网络分析显示不动杆菌属与假单胞菌属共现，并与耐药基因tnpA-01相关。由于该基因是一个可移动的遗传元件，这两个属可能在ARGs的水平基因转移中发挥作用。

有趣的是，这两个最主导的菌属，栖热菌属和海洋红嗜热盐菌，与ARGs呈负相关。栖热菌属与tetW呈负相关，海洋红嗜热盐菌与5个ARGs负相关，包括aadA1和aadA5。另外，海洋红嗜热盐菌与假单胞菌属负相关。

图7. 最高的20个菌属之间关系及4个最高菌属和9个核心ARG关系

小结

本研究的结果提供了一个全面了解的组成变化的微生物群落和抗性的牛粪处理三种管理策略，即好氧堆肥，沉淀和机械干燥。结果表明，沉淀法和机械干燥法生产的牛粪中仍含有大量的ARGs，是堆肥的近20倍。循环利用这些粪便作为土壤改良剂或牛床层将增加动物和人类接触到含肥料的ARGs的风险。与这两种方法相比，好氧堆肥在减少畜禽粪便污染方面更有效。经过14天的发酵，在三个季节中，超过83%的ARGs被去除。此外，潜在的ARG寄主不动杆菌和假单胞菌也大量减少，在堆肥过程中被热毒属和红毒属取代。作为MGEs的一种标记基因，tnpA-01的丰度与可能的ARG宿主的丰度存在显著的相关性，揭示了其在细菌间传播ARGs的关键作用。在堆肥过程中，温度对堆肥微生物和抗性的重塑起着重要的作用。 宏蛋白质组学表明，在堆肥过程中，高温(> 60℃)持续至少3天是杀灭病菌的必要条件。总体而言，本研究强调了粪便再利用对动物和人类健康的潜在风险，并为畜禽粪便管理提供了有前景的策略。

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1. Applied and Environmental Microbiology：Higher Temperatures Do Not Always Achieve Better Antibiotic Resistance Gene Removal in Anaerobic Digestion of Swine Manure.

2. Chemosphere: The profile of antibiotic resistance genes in pig manure composting shaped by composting stage: Mesophilic-thermophilic and cooling-maturation stages.