中科项目文章 | Autophagy :蛋白质组学+PRM助力三甲基氯化锡(TMT) 的神经毒理机制研究

发布时间： 2020-04-01 00:46 来源：上海中科新生命生物科技有限公司

氯化三甲基锡（TMT）在工业和农业领域中广泛用作杀菌剂，塑料稳定剂的组成部分，并且有文献证明，在食品，饮料和日用品中可检测到TMT。在过去的几十年中，不断中毒的案例报道。TMT被普遍认为具有有效的神经毒性作用，尤其是在海马中。然而，TMT诱导神经毒性的机制仍然不清楚。

2020年3月，第三军医大学研究团队在Autophagy（IF=11.059）杂志上在线发表了题为KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity的研究论文，利用蛋白组学技术揭示了巨自噬/自噬溶酶体机制在TMT诱导的神经毒性中的重要作用，并找出了关键蛋白质Kif5a，为今后的TMT毒性治疗提供了方向。

研究材料： Neuro-2a 细胞系，原代海马神经元， C57BL/6J小鼠

技术方法：TMT蛋白质组学+PRM

研究路线：

研究结果：

1.利用蛋白质组学发现自噬通路重要性

本文首先通过CCK-8分析确定TMT在Neuro-2a细胞中的神经毒性。用2、4和8μM TMT处理细胞24小时分别导致细胞活力降低约15％，31％和44％。然后，8μM TMT处理24小时的细胞进行了TMT标记定量蛋白质组学分析。与对照组相比，TMT组中共有340种差异表达的蛋白质，其中204种蛋白质发生上调（>1.2倍以上），而136种蛋白质发生了下调（<0.8倍以下）。通过对差异蛋白质进行KEGG与IPA分析发现，自噬在TMT诱导的神经毒性中应当起到重要作用。

图1蛋白质组学联合生信分析揭示自噬通路在TMT诱导神经毒性中的重要性

2.对TMT诱导的自噬通量受损进行验证

为进一步评估自噬对TMT诱导的神经元细胞死亡的影响，作者研究了TMT影响Neuro-2a细胞自噬通量的机制。TMT以剂量依赖的方式增加了LC3B-II：LC3B-I表达的比例，使SQSTM1水平升高。这表明TMT损害了自噬体的清除，导致它们在细胞质中的积累。这一结论支持TMT在Neuro-2a细胞中是一种有效的自噬抑制剂。

图2 TMT处理扰乱了神经细胞的自噬通量

3. TMT抑制Neuro-2a细胞中的自噬通量的机制探究

由于自噬是一个多步过程，作者进一步探究TMT对自噬的哪一阶段产生影响。结果表明，TMT不干扰自噬体的形成和成熟，不影响自噬体与溶酶体的融合，而是通过影响溶酶体的pH值以及造成组织蛋白酶的酶活缺陷影响溶酶体功能，进而造成了自噬通量的缺陷。

图3 TMT不会抑制Neuro-2a细胞中的自噬诱导或自噬成熟

图4 TMT不会抑制Neuro-2a细胞中的自噬体与溶酶体的融合

图5 TMT影响Neuro-2a细胞中的溶酶体pH及蛋白酶水解功能

4. KIF5A是TMT处理细胞过程中神经毒性相关的关键蛋白

通过进一步对蛋白质组学结果进行IPA分析，发现与自噬相关的关键蛋白KIF5A，利用western blot验证了TMT处理对KIF5A的显著下调。进一步的自噬通量表型研究发现在Neuro-2a细胞中过表达KIF5A可以逆转TMT诱导的神经细胞毒性，PRM分析发现TMT诱导的蛋白表达趋势同样可以得到逆转。

图6 IPA显示KIF5A与自噬途径变化蛋白的紧密关联

图7 Kif5a的过表达可逆转TMT诱导的神经细胞毒性

图8 PRM分析证实Kif5a的过表达可逆转TMT诱导对重要蛋白质的调控趋势

5. KIF5A在海马神经元中可以挽救TMT造成的溶酶体顺行运输缺陷

从小鼠体内分离得到原代海马神经元，接种在微流体腔上生长，并利用红色荧光标记溶酶体，使用运动记录仪记录溶酶体沿轴突运动的轨迹，发现TMT处理会造成溶酶体顺行运输缺陷，而这一缺陷可以被KIF5A的过表达挽救。

图9 Kif5a的过表达可挽救TMT诱导的溶酶体顺行运输缺陷

6. KIF5A在小鼠体内可以挽救TMT造成的癫痫和自噬通量缺陷引起的海马损伤

对小鼠进行TMT单次腹腔注射，进行TMT体内神经毒性的研究，发现注射24h后，小鼠出现癫痫以及海马神经元损伤，在分子层面上则表现为KIF5A表达下调、自噬体CTSB活性下调以及自噬通量缺陷。在小鼠体内过表达Kif5a可以在体内拮抗TMT诱导的神经毒性和自噬通量损伤。

图10 TMT对小鼠海马神经毒性的表现与Neuro-2a细胞类似

图11 Kif5a的过表达可以拮抗TMT诱导的体内神经毒性和自噬通量受损

研究亮点总结

本研究通过蛋白质组学结合生物信息学，对TMT的神经毒理机制进行了深入的研究：机制探索上，从重要通路到具体机制再到关键蛋白逐级深入，从自噬通路的锁定到对自噬通路的多个阶段进行细致的验证，将TMT对自噬通量的干扰锁定到对溶酶体功能的影响上，然后还寻找到了关键下调蛋白Kif5a，并且通过对Kif5a过表达对TMT诱导的神经毒性的逆转证实了Kif5a的重要作用；在机制验证上，从Neuro-2a细胞到原代海马神经元，再到小鼠体内实验，层层递进，对TMT的毒理机制以及过表达Kif5a对该神经毒性的逆转进行了从体外到体内的验证，为机制的未来应用提供了扎实的方向指引。