【Sci Rep 5.228】神奇虫子探险记！

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Large-scale massspectrometry-based analysis of Euplotesoctocarinatus supports the highfrequency of +1 programmedribosomal frameshift

摘要：

编程性核糖体移码（programmedribosomal frameshift）是一种重编码现象，它是指翻译中的核糖体能够在mRNA上特定的位置，从起始的0读框转换到+1或者−1读框，然后继续翻译的现象。该现象首次在病毒中发现，随后在从细菌到高等真核生物等生物进化的各个分支中均有报道。研究表明编程性核糖体移码是基因表达的一种调控方式。八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)是一种单细胞真核生物，前期研究表明约11.4%的基因需要发生+1位的翻译移码以产生其完整的蛋白产物，然而该预测仅基于核酸序列信息，缺乏蛋白数据支持。本实验应用shotgun LC-MS/MS技术，对八肋游仆虫的总蛋白进行了大规模质谱分析。

所得结果如下：

1）共鉴定得到2,842个蛋白，其中226个为+1编程性核糖体移码蛋白，其中高可信度核糖体移码蛋白130个；

2）根据质谱鉴定的肽段相对于移码位点的位置，我们将结果分为以下几种：仅覆盖+1读框的蛋白有74个，仅覆盖0读框的蛋白有65个，0读框和+1读框均有肽段覆盖的蛋白有85个；

3）移码位点被肽段完全覆盖的有6条，其中一条序列需发生两次+1位移码，根据移码位点肽段的氨基酸序列信息，我们确定了游仆虫中的移码发生于滑动序列AAA UAA中的U处；

4）质谱结果中包含14条含新型滑动序列的蛋白，证实了前期预测的新型滑动序列的+1PRF基因产物真实存在。

本研究首次对八肋游仆虫的总蛋白进行了大规模质谱分析，从蛋白水平对前期预测的+1位编程性核糖体移码基因进行了证实，并确定了八肋游仆虫中移码发生的位置，这为进一步探讨游仆虫中编程性核糖体移码机制奠定了基础。

研究背景

作为生命活动重要的一环，蛋白质翻译过程需要确保其精准度。核糖体正确读码对蛋白质的正确翻译尤为关键。Programmed ribosomal frameshift (PRM)，程序性核糖体移码是一种蛋白质翻译调节机制，主要有-1和+1两种形式。作者研究团队前期的工作表明，在八肋游仆虫中，约有11%的基因有1次或多次+1程序性核糖体移码来调控其蛋白质产物。相较于其他物种而言，这一比率是较高的。

样本来源

八肋游仆虫细胞（line 69）

研究技术

八肋游仆虫蛋白样品分别用Trypsin、GluC、chymotrypsin进行酶切，shotgun大规模定性分析。

研究结果

1. 三种处理方法的样本中共鉴定到2842种蛋白，其中包括226个+1PRF蛋白。也鉴定到两种由+1PRF编码的cAMP依赖性蛋白激酶（CUFF.27536.1）的肽段。

2. 根据检测到肽段中与+1PRF移码相关的位点，将226个+1PRF蛋白分成了四类（Figure 1）：a) 移码位点覆盖1~2个肽段（6个蛋白）；b）上游（0开放阅读框）与下游（+1PRF）移码位点都覆盖的肽段（81个蛋白）；c）只有下游（74个蛋白）移码位点覆盖的肽段；d）只有上游（65个蛋白）移码位点覆盖的肽段。

3. 重点分析了a类中6个蛋白，发现移码位点都在AAA-UAA的U上（Figure 2 A）。并根据其ORF和+1PRF预测其翻译的氨基酸序列（Figure 2 B）。

Figure 2. MS analysis of the six frameshift proteins. (A) Close-up of the frameshift region is shown. The AAA-UAA motif is shown in bold. The + 1 frameshift events are illustrated by curved arrows at the “skipped”nucleotides, which are underlined. The conceptual translations in the 0 reading frame and + 1 reading frame are aligned above and below the mRNA sequence, respectively. The amino acids of the peptides identified through mass spectrometry are indicated in red. (B) Complete amino acid sequence of the CUFF.27001.1 protein. The peptides identified by MS are indicated in red. The peptide spanning the frameshift site is underlined. The putative frameshift site is highlighted in green. (C) LC-MS/MS fragmentation spectrum of the shift site peptide YLMALCKKE from CUFF.27001.1. The insert shows the peptide sequence with ‘b− ’ and ‘y− ’ type fragment

ions that strongly support the shift site peptide identified in the LC-MS/MS analysis. The protein was alkylated with iodoacetamide to protect Cys residues.

4. 核酸层面的分析表明，八肋游仆虫有些基因需要2~3个+1PRF才能编码蛋白产物，其中就包括本实验中鉴定到的CUFF.27536.1蛋白（Figure 2 A）。该研究中鉴定到的肽段片段覆盖了该蛋白序列的64%。根据横跨两个移码位点的肽段序列信息成功定位到了这两个+1PRF的位点（Figure 2 A）。

5. 除了212个经典八肋游仆虫移码修饰（5’-AAA-UAR-3’）之外，该研究通过高通量的shotgun定性技术，还发现了14个具有新的+1PRF可变序列（Table 2）。

小编心得

本篇是利用高通量蛋白质组学定性研究（shotgun）来验证基因层面的翻译调控机制，发表在Scientific Report上的文献。在之前的基因组学研究基础上，不同的组学数据相互验证，系统地、完整地开展+1PRF在八肋游仆虫中的调节机制，并精确定位到其中一些蛋白的移码位点。为+1PRF蛋白质翻译调控的研究进一步夯实了理论基础。

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