【客户文章解读 IF 2.124】LC-MS/MS用于已知乙酰化修饰位点的鉴定

实验背景

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）参与多个代谢途径，能够影响细胞增殖、细胞凋亡、聚乙烯亚胺形成以及其他的一些生物进程。在生物体内，SAM只能通过腺苷甲硫氨酸合酶MAT（编码该酶的基因在生物体中非常保守）催化合成。同时，MAT也是体内甲硫氨酸循环的限速酶。哺乳动物中对MAT研究主要集中在一些疾病的应用治疗方面。赖氨酸乙酰化是一种非常常见的翻译后修饰，之前的文献报道通过乙酰化蛋白质组学在大肠杆菌体内发现腺苷甲硫氨酸合成酶（MAT）发生了乙酰化，但是这个修饰的生物学功能是未知的。

实验目的

解析腺苷甲硫氨酸合成酶（MAT）赖氨酸乙酰化的功能机制。

实验流程

之前的文献报道通过乙酰化蛋白质组学在大肠杆菌体内发现腺苷甲硫氨酸合成酶（MAT）发生了乙酰化，作者在大肠杆菌内过表达了MAT并且通过体外酶学实验证实了MAT能够乙酰化并且能够被CobB去乙酰化。

In vitro auto-acetylation of E. coli MAT

利用LC-MS/MS技术检测MAT体外酶学产物确定MAT的乙酰化位点K3, K18, K37, K98, K209, K222,K246,K266, K270, K284, K370,和K373。其中新发现了六个赖氨酸乙酰化位点（K18, K37, K98, K209, K222, K270），验证了之前文献报道中鉴定到的乙酰化位点（K246,K266, K370和 K373），而之前报道的K3和k284乙酰化位点没有被检测到。

LC-MS/MS analysis confirms that lysine 37 and 166 are acetylated in acetylated MAT and can be deacetylated by CobB

定点突变MAT蛋白并在体外进行其三聚磷酸酶活性，鉴定到的Lys166 (K166Q),Lys246 (K246R和K246Q), Lys266 (K266R和 K266Q)以及Lys270乙酰化位点会显著降低其酶活，而没有检测到的乙酰化位点K3R, K3Q, K154R, K154Q和 K284Q突变也显著降低了MAT的体外酶活性。

Effects of reversible acetylation on tripolyphosphatase activity of MAT in vitro.

体外三聚磷酸酶实验证实乙酰化MAT能降低其酶活，而CobB去乙酰化MAT能回复乙酰化MAT的酶活，暗示CobB能够在体外通过去乙酰化MAT从而调节其酶活性。

实验结果

Structural analysis of the lysine acetylation-related inhibitory effect to the MAT tripolyphosphatase activity.

作者在大肠杆菌体内过表达了MAT，然后通过lc-ms/ms技术检测了纯化的MAT蛋白的乙酰化位点，并且通过定点突变MAT蛋白验证了该蛋白赖氨酸乙酰化在其酶活性中的作用。而且在体外比较了MAT乙酰化以及去乙酰化的酶活性，结果暗示CobB能够在体外通过去乙酰化MAT从而调节其酶活性。