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生物药的研发(一): LC-MS/MS技术在生产和工艺开发中的新应用

发布时间: 2020-03-13 12:56:28 来源:SCIEX

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声音节目已更新至第三期


本期“婷视角”专栏,婷姐谈生物药的研发第1期:LC-MS/MS技术在生产和工艺开发中的新应用。


本期声音内容

Hey,大家好,我是您的质谱应用专家刘婷,来自SCIEX中国市场部,负责高级解决方案的开发与支持。15年的一线应用经验,让我深感到质谱应用信息共享的重要性。无论是质谱前沿技术,还是常用技术的深入应用,都希望在我的这个专栏中能和大家分享。“婷视角,看分析“希望拓宽您的视野,进入美妙的的质谱应用世界。



01

大家好,我们又见面了。“婷视角”本系列内容的关键词是“生物技术药物”“液质联用技术(LC-MS/MS)和毛细管电泳技术(CE)”。自1982年美国FDA批准第一个基因工程产品——重组人胰岛素(Humulin)由美国礼来公司(Eli Lilly and Company)推向市场以来,生物技术药物的研究开发速度不断加快。21世纪以来,我国的生物技术药物市场增长强劲。2019年李克强总理在全国十三届全国人大二次会议上的《政府工作报告》中重申了中国对生物制药的支持,承诺要在“生物医药”等技术领域“培育新兴产业集群”[1]。中共中央政治局在今年的2月21日召开的会议中也指出:将推动生物医药行业发展。相信国家对于生物技术药物的投入和支持,又可以激发一次产业研发热潮。



“液质联用和毛细管电泳技术”作为在生物技术药物研发过程中使用越来越多的仪器,主要参与了两方面的研究,即:生物技术药物的质量控制和药代动力学研究(表1)。这两方面研究中,除了大家所熟知的,生物技术药物的相对分子量测定,已知蛋白序列分析,肽谱分析,二硫键分析,蛋白质及肽段的磷酸化及糖基化,生物样品定量等方面的应用外,“液质联用和毛细管电泳”还可以应用到一些大家并不是特别了解的热点研究上,如:细胞培养上清液和培养基监控一次性使用系统(Single Use System, SUS)的萃取物及可浸出物研究生物技术药物的宿主细胞蛋白(Host Cell Protein, HCP)测定蛋白药代谢物鉴定,和聚乙二醇化蛋白类药物定量等诸多方面, 因此我们将通过五期内容来介绍这些新的应用。

(点击查看大图)


02

本期内容主要介绍LC-MS/MS技术在生物技术药物生产和工艺开发中的新应用,包括“细胞培养上清液或培养基监控”“一次性使用系统的萃取物及可浸出物(Extractables and Leachables,E&L)研究”两个方面。


我们先来看第一个主题:细胞培养上清液或培养基监控。在生物技术药物生产中,我们希望了解培养基中各投料组分,如:糖,氨基酸,有机酸,维生素,核苷酸等成分,它们在培养过程中的变化以及其对目标产物质量和产量的影响。因此尽可能快速、准确、高通量地了解这些组分在细胞培养上清液中的变化趋势就变得至关重要。以前,不同种类的化合物,比如:糖和核苷,要使用不同的方法进行测定,很是麻烦;现在使用一个LC-MS/MS方法即能做到上百种化合物的高通量快速检测。 


SCIEX北美专家Zuzana[2]基于QTRAP®质谱仪,即三重四极杆线性离子阱复合型质谱仪,一针定量、定性细胞上清液或培养基中110中化合物,使用MRM做定量分析,QTRAP系统的增强子离子扫描模式(Enhanced Product Ion, EPI)做定性分析。该方法既可用于化合物的绝对定量,又适用于没有标准品情况下的相对定量、定性分析。

第二个主题是关于“一次性使用系统中的E&L”研究。在生物技术药物生产中,常常会使用一次性塑料系统。检测一次性系统可能会发生迁移,并最终进入产品并影响药物质量或安全性的化学成分,其后对这些成分进行毒理学评估非常必要。在E&L检测中, LC-PDA/UV-MS发挥了不可替代的作用。其分析流程一般分为:靶向分析和非靶向分析。


靶向分析,即根据目标化合物,建立定量、定性检测方法。其特点是:可以针对常见的溶出物,建立高灵敏度、有效快速的监测方法,评价安全性。适用于红色警戒化合物或是有明确毒副作用化合物的筛查和定量检测。目前,主要的应用在增塑剂、抗氧化剂、稳定剂、硫化促进剂等化合物的检测[3][4]。如我们使用QTRAP®质谱仪特有的“杆-阱扫描”(MRM-IDA-EPI)流程对某氯化丁基橡胶塞的甲苯浸提物进行筛查,结果检出包括抗氧化剂、塑料添加剂和邻苯二甲酸酯类增塑剂在内的20种化合物[5]


特别要提到的是,我们传统认为靶向分析主要由常规分辨率质谱仪器分析。但我们使用高分辨质谱仪器(High Resolution Mass Spectrometer, HRMS)的高分辨多反应监测模式(MRMHR),检测荧光增白剂的实际测定结果可看出,HRMS的MRMHR模式也具有液质联用三重四极杆质谱的灵敏度和线性范围[6]


非靶向分析,往往是“一次性使用系统”常见的检测方式,需要对溶出迁移物进行“半定量”和“定性”分析。一次性系统E&L验证的主要法规“BPOG (BioPhorum Operations Group) 标准” 和“USP <665>”中规定:需要使用不同极性溶剂,和不同PH溶剂,甚至不同温度,溶解不同材质的接触材料,这提示可能会有大量未知化合物需要被鉴定,高分辨质谱优异的广谱检测和定性鉴定能力使其成为了E&L研究中鉴定“未知化合物”的明星工具。


欧盟农残参比实验室(EU Reference Lab)负责人/西班牙Almeria大学教授 Amadeo Rodríguez Fernández-Alba[7]使用SWATH采集模式进行“E&L”研究;文中指出SWATH采集技术和其他采集技术相比,在鉴定未知化合物上有显著优势, 特别是在未设置任何目标性采集条件下,能做到样品中未知化合物的TOF MS和TOF MS/MS信息全覆盖。SCIEX北美专家Rolf[8]也发现SWATH采集技术在E&L研究中具有很强的应用价值。 


在鉴定上,鉴定未知化合物的可能结构仍然是E&L研究中的瓶颈问题。如何更好的解决这个问题?建立“高分辨数据库”是一个强有力的工具。因此SCIEX通过一年的时间,建立了>700种化合物的高分辨MS/MS数据库 和 >3000个化合物的分子式列表,助力E&L研究的高效鉴定。通过实验验证发现[9][10],使用该“E&L高分辨数据库”,能快速鉴定“一次性使用系统”和“食品包装材料”中的未知溶出迁移物,大大缩短了鉴定时间,提高工作效率。


最后,总结一下本期内容:

  1. LC-MS/MS方法能一针进样,准确、快速测定细胞上清液或培养基中的相关物质;灵敏度高,准确性好;

  2. LC-MS/MS方法已成为“一次性使用系统E&L研究”的必备工具;SWATH采集技术和” E&L高分辨数据库”将助力您的E&L研究;

本期内容,我们主要了解到LC-MS/MS方法在生物技术药物的2个新热点领域,即 “细胞培养上清液或培养基监控”“一次性使用系统萃取物及可浸出物研究”中的应用。下期内容,我们将主要介绍“生物治疗药物中宿主细胞蛋白(HCP)残留分析”, 尽请期待!


参考文献
1. 第十三届全国人民代表大会第二次会议. 政府工作报告[N/OL]. 2019 [2019.03.16] http://www.gov.cn/zhuanti/2019qglh/2019lhzfgzbg/
2. Zuzana D, Lei X. Quantitative LC-MS Solution for Targeted Analysis of Cell Culture Media; SCIEX Poster; 
3. 孙小杰, et al. 快速测定厨房用具,染制品以及食品包装材料中的33种初级芳香胺;SCIEX Technote;
4. 马小锋, et al. SCIEX Triple Quad™ 4500在食品塑料包材中8种抗氧化剂的应用;SCIEX Technote;
5. 陈西, et al. QTRAP® 质谱仪在包装材料可提取物筛查中的应用;SCIEX Technote;
6. 孙雯雯, et al. X500R QTOF系统在纸质食品接触材料中荧光增白剂检测的应用;SCIEX Technote;
7. María José Gómez Ramos, Ana Lozano, Amadeo R. Fernández-Alba. High-resolution mass spectrometry with data independent acquisition for the comprehensive non-targeted analysis of migrating chemicals coming from multilayer plastic packaging materials used for fruit purée and juice[J]. Talanta, 2018, 186.
8. Rolf Kern, et al. Extractables and Leachables Analysis Using a Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometer and SWATH® Acquisition;SCIEX Technote;
9. 王姗姗, et al. X500 QTOF系列高分辨质谱在药物一次性包装材料可提取物和 浸出物(E&L)检测方面的应用; SCIEX Technote;
10. 赵祥龙, et al. X500R QTOF系统在包装材料提取物筛查中的应用;SCIEX Technote;


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