【Zeno SWATH DIA新技术】纳升流速下的高灵敏度蛋白质组鉴定和定量

纳升液相系统因具有非常高的灵敏度，常用于蛋白质组学工作流程中，特别是当可用样品量非常低的时候。高质量的色谱分离对于蛋白质鉴定很重要，因为良好的峰形和分离可以减少离子抑制，并允许质谱系统采样尽可能多的特异性肽段。

在本研究中，我们结合使用纳升液相系统与Zeno SWATH DIA流程，以评估ZenoTOF™ 7600系统使用纳升系统时蛋白鉴定和定量的能力。

►液相方法：液相系统：NanoLC 425系统(SCIEX)，色谱柱：核壳Biozen 5 μm Peptide XB-C18 (0.075 x 500 mm, 5 μm, P/N 00j -4792- w - sx)，流速：400 nL/min，梯度：60min。

►质谱方法：质谱：ZenoTOF™ 7600系统，离子源：OptiFlow Turbo V离子源，采集模式：Zeno SWATH DIA，可变窗口数：100个，累积时间：25毫秒，二级MS/MS模式下启用Zeno Trap（Zeno阱），样品采集三份平行数据。

►数据分析：Zeno SWATH DIA数据使用DIA- NN软件处理，分别使用自建库和非自建库流程，数据库为之前由OneOmics生成的人细胞裂解液数据库。

主要结果：

1.不同进样量时蛋白质鉴定和定量测试

我们使用K562细胞裂解液样品，在1小时的液相梯度中，使用Zeno SWATH DIA采集质谱数据，在DIA-NN中采用自建库分析，发现随着上样量的增加，蛋白质的鉴定数也增加了（图1）。在三次重复实验中，确定FDR <1%，CV <20%的定量蛋白质数量。当柱上进样200 ng样品时，鉴定蛋白质约6800个，可定量蛋白质约6300个(92%)。

图1. 不同进样量时蛋白质鉴定和定量数量

对比不同进样量时定量到的FDR <1%，CV <20%肽段，可以看到随着进样量增加，60min纳升流速梯度中鉴定（空心标志）和定量（实心标志）的肽段数量也在增加（图2）。在100 ng进样量时，约67,000个肽段被鉴定到，其中约80%被定量到。

图2. 不同进样量时肽段鉴定和定量数量

2.数据分析时使用自建数据库和非自建库对比

我们使用DIA-NN软件对比了相同Zeno SWATH DIA数据在使用自建数据库和不使用自建库时，蛋白质鉴定和定量数量的区别。自建数据库方法中使用的数据库为之前通过DDA鉴定建立的人细胞裂解液数据库；非自建库方法中使用的为从人FASTA文件中生成的理论数据库。在蛋白质和肽段的鉴定和定量中，两个方法所得到的结果非常相似。此外，使用另外一个理论公共数据库Pan human数据库时，Zeno SWATH DIA数据也能得到类似的结果（图3左上及右上）。

为了进一步测试非自建库方法的保真度，对使用理论数据库与DDA自建库中分别鉴定到的蛋白质进行对比。维恩图(图3，下)显示，这些方法可以得到非常接近的结果，这进一步表明使用理论数据库也可以得到很好的蛋白质鉴定和定量分析结果，将给Zeno SWATH DIA数据分析带来很大的便利。

图3. 对比三种不同数据库处理数据时的蛋白鉴定结果

图3说明：3个不同的数据库（Lib Free，使用在FASTA文件的理论库；PHL，Pan human公共数据库；ZT Lib，根据Zeno DDA建立的数据库）。上图为FDR <1%（柱状图透明部分）和CV <20%（柱状图实心部分）时蛋白质鉴定和定量数量，下图为使用非自建数据库方法或自建库方法中鉴定蛋白质的数量对比，二者重合度很高。