蓝天碧水净土之 SCIEX 高分辨质谱篇

今年4月22日是第48个世界地球日，珍爱地球、守护家园是我们每个人的愿望。在2019年的政府工作报告中，在碧水、净土保卫战方面，要求加强化水、土壤污染防治。我们可以看到环境污染物的研究已经成为环境保护研究领域的热点。

随着检测技术日新月异的发展，高分辨飞行时间质谱技术（QTOF）也越来越多的应用在环境污染物的监测、风险预警以及环境科学研究中，并发挥着重要的作用。SCIEX QTOF液质联用系统，一直以来都助力于环境新兴有机污染物筛查、环境降解产物的鉴定、环境代谢组学以及环境暴露风险评估等领域的研究。

基于SCIEX QTOF 系列质谱的SWATH®采集技术是一项突破性技术。SWATH®（Sequential Window Acquisition of all TheoreticalMass Spectra）采集技术是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi博士及其团队与SCIEX在2012年联合推出的一项全新的高分辨质谱采集技术。SWATH®技术是一种真正全景式的、高通量的、数据可追溯的质谱技术。SWATH®属于数据非依赖型扫描，它允许一次进样，即可采集到样本中所有可检测化合物的一级和二级质谱信息。因此实现一次分析即可对样本进行全面鉴定和定量分析。重要的是数据可追溯性，这项技术为整个样品创建永久定性和定量数据记录。

图1. SWATH®采集技术进行MS/MS扫描时，Q1分窗口依次传输母离子进入Q2打碎，获得相应窗口母离子的所有碎片的MS/MS谱图。

科罗拉多矿业学院土木与环境工程系副教授 Christopher Higgins 博士说，“作为环境化学家，我们始终在努力发现具有重要意义的新化合物，不论是在饮用水和雨水中，还是在生物群内。“SWATH®采集技术为我们提供了收集和归档数据的机会，因此我们能够重新检验旧数据，而不需要重新采集。对于样品通常有限的环境监测工作而言，这是一种重要优势”。

SCIEX可以提供一系列针对环境科学的研究流程：比如新型未知物筛查鉴定、环境污染物降解机理、环境代谢组学等，请参考以下应用案例。

应用案例一. 饮用水处理前后的高分辨率数据结合统计学软件的创新非靶向筛查流程

通过LC-QTOF技术对饮用水处理流程中的原水和处理后的水中的未知物进行筛查和鉴定。数据采集运用了创新的一针进样同时进行数据非依赖采集（SWATH®采集技术）模式。高分辨率数据与结合了统计学软件（MarkerView^TM软件）的非靶向数据处理流程是实现未知物结构鉴定的关键。未知物的筛查方法是先通过统计学方法找出重要的有差异的化合物，然后再对找出的差异化合物进行谱库搜索。样品中未知物的筛查范围包括缓蚀剂、人工甜味剂和药物。实验表明原水、处理过的水和深度处理过的水中的组分是不同的。

筛查实验使用了SWATH®采集技术，此技术可保证样品中所有可检测到的化合物均采集到二级谱图。利用SCIEX 一体化二级谱库并结合NIST库进行筛查，可筛查到更多化合物，从而减少了需要手动进行结构鉴定，提高效率。MarkerView软件可用于识别出不同样品中的特征物质。这个软件中的统计工具可以对样品组间的差异进行细致的分析，并对复杂的未知物组成进行表征。

图2: MarkerView软件中的TOF MS数据（正离子模式）。载荷图和PCA（主成分分析）图在样品组间差异上能提供非常有用的信息。载荷图（上）：利用MLR方法对数据进行归一化。每个点代表一个特征峰，不同的颜色代表不同的样品组。PCA图（下）显示了不同样品在显示了不同样品在主成分1和主成分2的图（PC1 vs PC2）上聚集。PC1 vs PC2图展示的是导致样品组间显著不同的两个最大变量。

样品和样品制备：

本实验对几种不同的水进行了微量有机成分的筛查：

1、高级氧化法（Advanced Oxidation Process，AOP）进出口：高级氧化技术处理前后的水

2、安德森，卡莱罗：来自加利福尼亚两个不同水库的水

3、WQ12：微滤膜过滤后 / 反渗透之前的水

4、WQ8：反渗透装置的反冲水

5、PWTP或STWTP原水：从两个不同的水处理厂（Water Treatment Plant，WTP） “P”或“ST”中的一个取样的饮用水处理进口水。这个进口水来源于水库

6、PWTP or STWTP 出口水：从两个不同的水处理厂（“P”或“ST”）中的一个取样的饮用水处理出口水。

通常做的可疑物列表筛查的工作流程比较直观易懂，方法设置和搜库也很简单，但往往会导致信息量过大，样本多的话，筛查时间非常长，而且在多个样本或样本组之间进行比较也会比较麻烦。基于这一点考虑，采用了新的工作流程，其目的是首先缩小在未知样本中待鉴定的化合物列表。在这种方法中，利用MarkerView软件的统计学功能来对不同的水样进行表征。将高分辨率、准确的QTOF数据导入到MarkerView软件中，以寻找不同水样中的特征物质；然后将这些特征物质生成一个“兴趣峰”列表，配合SCIEX OS软件对这些特征峰进行鉴定。

MarkerView软件是此工作流程的关键组成部分。实验采集的所有样本的TOF MS数据都可以导入该软件中，然后该软件可以提取所有相关的特征峰（唯一的m/z和保留时间定义一个峰），并生成一个特征化合物列表，然后就可以在软件内进行各种统计分析。图2显示了不同水样PCA分析的得分和载荷图。从中可以清楚地看出，在基于这些特征峰画出的图上，样本组之间有明显区别。下一步就是进一步研究这些特性峰中哪些是一个或多个感兴趣的样本组所独有的。图3展示了一个这样的例子，图中提取了载荷图最末端的部分特征峰以生成一个组分分布图。在载荷图最远端的特征峰表示该PCA特征组最具特征性的物质（在这个例子中，表示在一个样本组中存在而在另一个样本组中相对不存在）。这一有价值的信息可以帮助我们生成一个特征峰列表，这个列表中的峰一旦被鉴定（初步或更严格的确认），我们就可以得到样本间的差异或变化的信息。

图3：载荷图可以快速得到不同样本的特征组分。本图将载荷图右上角圆圈中的峰单独显示出来。在这些特征峰的提取图中，图例显示了每个特征峰的特征标识（m/z和保留时间），图中的点表示用特征峰的强度对它所在的样本作图。这部分特征峰在WQ样品组中的强度明显高于其他样品组。因此，这些特征峰被确定为WQ组水样的特征成分，值得被进一步研究。

在MarkerView软件中利用统计工具生成了“兴趣峰”列表后，就可以在SCIEX OS软件中对这个目标列表进行数据处理。这些特征峰的处理遵循相同的疑似物筛查原则。高分辨率TOF MS数据用于生成特征峰可能的分子式，并利用搜库功能寻找匹配的结构。图4显示了一些由t检验产生的特征峰与候选结构的匹配情况。

图4. “兴趣峰”列表中化合物的鉴定。利用SCIEX OS软件对PWTP原水样品和处理后的水样之间的显著差异峰进行了结构匹配。A）在PWTP 原水中，特征峰m / z 502.3（RT 7.9 min）的响应比PWTP处理后水样中更高。该化合物似乎在PWTP处理过程中发生了转化。B）从左到右分别为：该化合物在7.9 min时的色谱峰；高分辨一级质谱图和预测的分子式[C32H39NO4+H]+；该化合物的二级谱图和谱库中与之匹配的药物非索非那定的二级谱图。预测的分子式与非索非那定的分子式相匹配，并且碎片离子的匹配度极高（Fit得分为100）。

小结：对于数据量庞大，并且更加关注差异物的寻找，如本实验中进水样品组和出水样品组之间的差异成分的鉴定，可以首先利用MarkerView软件找出显著差异峰，数据处理可以更侧重于样品中差异峰的鉴定。这样工作流程能变得更为合理和简单高效。

应用案例二. SCIEX X500R QTOF系统在环境中抗生素降解研究中的应用

基于SCIEX X500R QTOF系统在降解产物研究中的靶向和非靶向数据处理流程，共找到分属于6条降解途径的14个降解产物。SCIEX X500R QTOF系统拥有超快的扫描速度和加入了独有技术（DBS）的合理扫描方式，能够一针进样同时得到感兴趣（包括低浓度）化合物的一级和二级质谱图，OS软件操作简单直观，功能强大，高自动化程序能够进行定性的批量处理，帮助用户轻松实现科研目标。

磺胺甲噁唑在CuFe2O4/HA体系中的氧化降解途径

应用案例三. 高通量非靶向代谢组学

研究低浓度的六溴环十二烷同分异构体对拟南芥叶片代谢的影响

基于TripleTOF® 6600系统，以其超高的扫描速度和数据依赖型扫描（IDA）模式，一针进样即可获得TOF-MS和TOF-MS/MS数据。结合数据后处理软件，能够提供高效快捷一体化的组学解决方案。本实验研究了六溴环十二烷同分异构体(HBCDs)三种同分异构体在拟南芥叶片中的毒性分析和代谢作用。13种代谢物被鉴定为潜在的生物标志物，用于鉴别植物叶片中HBCD毒性的存在并影响了多种代谢途径。

应用案例四. 手性PCB 91在蚯蚓体内代谢组学和脂质组学的研究

TripleTOF® 5600系统，一针进样得到的高质量一级和二级质谱数据。本实验研究了手性多氯联苯 91（PCB 91）蚯蚓体内的代谢作用。通过SCIEX 专业的高分辨代谢产物二级谱库进行代谢物鉴定，通过LipidView^TM软件自动鉴定出暴露组和对照组之间存在显著差异的脂质。结合Markerview^TM软件进行差异物分析。代谢组学和脂质组学分析表明，即使在低生物体-沉积物积累因子（BSAF）下，与(-)-PCB 91相比，(+)-PCB 91显著改变了108种代谢物和25溶血磷脂的表达。这显示出明显的立体选择性影响。为手性多氯联苯暴露环境风险的综合评价提供了新的视角。

MarkerView^TM和LipidView^TM软件