高深度空间代谢组学助力肿瘤微环境研究

肿瘤的发展除了与癌细胞自身基因突变导致的恶性增殖有关以外，还与肿瘤微环境息息相关。在癌症中，正常组织中和谐的细胞相互作用关系被破坏，原本保护正常细胞生存的微环境在肿瘤细胞的影响下，逐渐演变成适应肿瘤生长的条件。针对肿瘤微环境的检测和表征研究也可为癌症治疗提供新的思路。

目前空间多组学技术已用于研究几种类型癌症中肿瘤免疫微环境的转录组、蛋白质组和代谢组，从这些方法获得的数据已与免疫组化和多参数分析相结合，以产生癌症进展的标记物。传统分析技术受样品空间分辨率以及分析灵敏度的限制，无法精准获取靶向部位，而对其中特异代谢物的差异表征就更加困难。组织切片伴随着显微镜技术等的发展而得到广泛的应用，而激光显微切割 (LMD, laser microdissection) 技术可以方便地对特定的组织区域的精确分离（图2）。结合高灵敏度的液质联用检测技术，基于ZenoTOF^® 7600 系统，将空间定位准确的微区细胞代谢谱进行全面准确的表征。代谢谱是免疫微环境的重要调节因子，可能通过影响癌细胞的增殖潜能和适应环境而发挥作用。代谢特征的异质性似乎有助于肿瘤免疫微环境的异质性。

肿瘤微区样品制备

由制备好的肿瘤组织切片样本置于激光显微切割载物台，确定好焦距平面后，将视野移动到待切割的细胞区域（先通过H&E染色的平行样本确定肿瘤组织分区），在调节好相关参数后开始进行切割。通过对样本分别进行水溶性代谢物和脂溶性代谢物的提取，进而进行基于液质联用系统的全面的代谢组学分析。

图2. 组织切片样本用于激光显微切割分离体制备。经过苏木精-伊红（HE）染色确定组织切片中不同类型的细胞区域（左）包括原位癌、浸润癌和癌旁细胞，在平行的未染色组织切片中的相应位置进行激光显微切割获得分离体（右）。

 代谢物全面表征   

组织细胞中代谢物成分复杂多样，且有较多同分异构体，仅有准确的高分辨一级无法对化合物进行确证。针对大量样本，SCIEX OS软件可自动进行峰提取和搜库，通过一级质量数、同位素丰度和二级碎片的匹配对样本中的代谢物进行鉴别（图3），使筛查流程快速准确。在代谢组学的样本中共鉴定173个化合物，包括氨基酸类、核苷类、吲哚类、脂肪酸类等。

图3. 代谢物鉴定界面示例。以样本中鉴定到的脯氨酸（Proline）为例，Proline分子式为C₅H₉NO₂，检测到的MS信号与理论质荷比相比，质量数偏差为-0.3ppm，同位素丰度比与理论值偏差为1.3%，MSMS与代谢物库中Proline的标准谱图匹配度为100，以此可判定鉴定到的信号为Proline。

在脂质组学分析样本中共鉴定到550个脂质化合物，基于ZenoTOF^® 7600 系统特有的电子活化解离（EAD）碎裂模式，可以鉴定出其中一些脂质化合物的精细结构，如脂肪酸链连接的具体位置（sn1或sn2）以及连接的不饱和脂肪酸双键的具体位置（图4）；对于样本中检测到的脂质化合物包括固醇酯类、神经酰胺类、溶血磷脂胆碱类、磷脂胆碱类、溶血磷脂乙醇胺类、磷脂乙醇胺类、磷脂肌醇类、磷脂丝氨酸类、鞘酯类、甘油二酯类、甘油三酯类。

图4. 脂质化合物精细结构鉴定示例。以甘油三酯TG (18:1/18:1/18:1)为例，在EAD碎裂模式下，化合物[M+Na]+峰可以产生特征的碎片离子，帮助解析甘油三个羟基各自所连接的脂肪酸组成，以及在高质荷比区域产生的连续CH2断裂碎片确定不饱和键的位置（C9和C10间为双键）。

差异代谢物分析

在质控样本（quality control, QC, 所有样本等体积混合，整个分析批次中每6个样本穿插一针QC样本进样）中，化合物峰面积RSD%不超过30%（n=8），在代谢组学样本中共检出100个代谢物，脂质组学样本中共检出502个代谢物，并将这些化合物在所有的样本包括原位癌组织、浸润癌组织、癌旁组织进行峰面积提取。

将获得的各种组织中化合物含量信息进行生物统计学分析，以浸润癌组织v.s.癌旁组织为例，共找到84个差异代谢物（图5）。经过后续进一步生物学验证，确定的差异代谢物可以帮助开展癌细胞在空间定位及异质性的精准区分工作，更好的理解例如肿瘤转移的起源和发展、侵袭能力、对药物的敏感性等方面的特点，从而制定个体化的精准治疗方案。

图5. 浸润癌组织v.s.癌旁组织中的差异代谢物热图。通过统计学分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA计算的VIP值不小于1作为筛选条件，获得了84个差异代谢物。

总结    

通过对组织切片进行激光显微切割获取空间定位准确的微量样本，并与SCIEX ZenoTOF^® 7600 系统相结合，实现微量细胞水溶性和脂溶性代谢物的全面表征以及高灵敏度组学分析。可将此方案应用于其他组织切片样本，助力空间多组学研究的开展。

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