n  服务简介

不同的同位素培养基分别培养实验组和对照组细胞，达到体内标记的目的。在此基础上进行Co-IP实验，依靠抗原与抗体之间的专一性反应分离得到免疫复合物；之后，利用LC-MS/MS来定性和定量免疫复合物中的蛋白：当实验组与对照组中某个蛋白质的含量达到统计学差异时，判定这个蛋白质与诱饵蛋白质具有相互作用。

n  技术优势

1、特异性强，结果可信，假阳性极低；

2、灵敏度高，样本需求量少；

3、高通量，能一次性检测到多种互作蛋白；

4、能直接检测出与bait蛋白互作的其它蛋白的相对含量

n  服务内容

1、细胞同位素标记           4、液质联用检测
2、蛋白提取、免疫沉淀；     5、数据库检索和定性、定量分析
3、蛋白分离                 6、相互作用蛋白的生物信息学分析

n  技术应用

3.5.1野生型细胞系（图1)

1、分别用轻、重链氨基酸培养2组相同的野生型细胞，培养至第5~6代时做标记测试；

2、待标记完全后，取等量的2组细胞提取蛋白质；

3、提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗诱饵蛋白的特异性抗体做免疫共沉淀（Co-IP）；

4、混合轻、重链Co-IP产物，SDS-PAGE分离；

5、胶内酶切，肽段抽提、纯化；

6、LC-MS/MS定性和定量免疫复合物中的蛋白质（图1：成对出现的峰为非特异性结合蛋白）。

 3.5.2基因过表达细胞系（图2)

1、构建兴趣基因(带标签)的过表达细胞系和对照细胞系；

2、分别用轻、重链氨基酸培养上述2组细胞系，培养至第5~6代时做标记测试；

3、待标记完全后，取等量的2组细胞混合并提取蛋白质；

4、轻、重链蛋白混合物用标签蛋白的抗体做Co-IP；

5、（1）若抗体和磁珠非化学偶联，Co-IP洗脱液中常有抗体干扰，需要用SDS-PAGE胶分离的方法先去除抗体轻、重链，之后做蛋白条带的胶内酶切并抽提肽段；

   （2）若抗体和磁珠已化学偶联，做SDS-PAGE确认是否无抗体干扰；在确保无干扰的情况下，进行溶液内酶切，之后做LC将肽段混合物分为多个组分；

6、胶内酶切的肽段组分或一维LC分离的肽段组分再经LC-MS/MS，得到免疫复合物中蛋白质的定性和定量信息。

3.5.3基因干扰细胞系（图3）

1、构建兴趣基因的干扰细胞系和对照细胞系；

2、分别用轻、重链氨基酸培养上述2组细胞系，培养至第5~6代时做标记测试；

3、待标记完全后，取等量的2组细胞混合并提取蛋白质；

4、轻、重链蛋白混合物用兴趣蛋白的抗体做Co-IP；

5、同上，亦可采用2种方法：

（1） SDS-PAGE分离蛋白质、胶内酶切；

（2） 溶液内酶切、LC分离肽段；

 6、肽段再经LC-MS/MS，得到免疫复合物中蛋白质的定性和定量信息。

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