对血浆C-反应蛋白(一种潜在的炎症生物标志物)进行高灵敏度且 可重现的LC-MS定量分析

简介

 C-反应蛋白(CRP)1 在肝脏中天然合成，并作为炎症响应因子被释放到血液中。 因此，通过测定CRP来诊断类风湿性关节炎(RA)2,4等慢性炎症以及评估心血 管疾病风险3 和炎性癌变过程4 的方法受到广泛关注。组织损伤或炎症会使血 浆CRP浓度升高100倍以上2 。健康个体的内源性血浆CRP浓度相对较低，一 般为0.1～3 µg/mL (4～120 nM)2 ，但患者体内的CRP浓度却高出许多，要实 现准确定量，需要使用多重ELISA或比浊免疫法3 。由于需要进行多重测试， 样品浓度范围往往会超出配体结合试验(LBA)方法的线性动态范围。除了这 一固有劣势之外，还有很多其它原因促使业界逐渐转向采用LC-MS方法， 例如缺乏标准化方法、可能发生交叉反应、成本高昂、难以保证试剂配制的 一致性等等，而这些只是众多原因中的一小部分。质谱检测在蛋白质定量方 面拥有诸多优势，如灵敏度高、专属性高、线性动态范围宽、方法开发速度 快以及可进行多重分析等。不过，蛋白质的LC-MS定量方法仍然面临许多难 题。目前这种方法还没有形成一套标准化的工作流程，而现有的各种工作流 程往往复杂又繁琐，使得科学家们难以成功完成分析。本应用纪要介绍了一 种通用试剂盒方案，相较于文献中耗时长达24 h的标准方法5 ，该方法仅需 2 h即可完成酶解。酶解和后续的肽纯化步骤采用ProteinWorks eXpress直 接酶解试剂盒(部件号：176003688)和ProteinWorks µElution SPE净化试 剂盒(部件号：186008304)完成，以准确、可靠地定量人血浆中的内源性 CRP。采用上述试剂盒及其随附的方案，我们仅使用35 µL血浆样品就达到 了0.025～0.1 µg/mL (1～4 nM)的LLOQ。