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工商注册信息已核实!图1:β淀粉样肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI数据
MRM跃迁态和条件:见表1
样品预处理
注意:对于加标样品而言,在加标后、用盐酸胍稀释前,可在室温下让样品平衡30分钟。
固相萃取(SPE)
基于µElution 96孔型的Oasis® MCX
稀释:25µL水
进样量:20µL
表1:β淀粉样肽及其N15标记型内标的MRM跃迁态和质谱条件
结果和讨论
开发这些方法所遇到的最大挑战就是克服溶解性、吸附性和聚集性问题并获得能满足该应用要求的足够选择性和灵敏度。适当的流动相和进样溶剂构成以及明智选择SPE洗脱溶剂仅仅是应对这些问题的几个关键因素。
质谱分析
质谱分析在正离子模式下进行,因为4+前体的CID产生了几种与固有的特异性b序列离子相对应的不同产物离子(典型光谱如图2所示)。负离子模式下的MS/MS出现了明显的水分流失。图3给出了关于两种方法特异性区别的一个示例。虽然对于溶剂标准品时使用负离子模式的总体灵敏度较高,但在基质存在时负离子模式的灵敏度优势减弱,而正离子模式下的特异度和信噪比的提高对于脑脊液样品中的准确定量具有决定性作用。
超高效液相色谱分析
图4显示了对这三种β淀粉样肽的分离情况。虽然流动相中NH4OH的精确百分比对负离子灵敏度具有关键作用,但ESI+模式下的信号经证实对流动相构成的细微变化更具稳健性,可使液相色谱/自动取样器至少在24小时以上的时间段中保持稳定。与此相反,50%或以上的ESI-信号在10-12小时后因流动相中NH4OH浓度的自然变化(挥发)而损失。这进一步强调了ESI+MS方法的稳健性。
固相萃取(SPE)
SPE是整个方法中较为重要的环节之一。对淀粉样组分选择性极高的分离再加上标准流速下UPLC的分辨率实现了对临床前研究样品的超快分析。
线性、准确度和精确度
用3种人脑脊液混合样品和1种猴脑脊液混合样品配制了0.2、0.8、2和6ng/mL的过量加标的质控样品。准确度和精确度数值符合LC/MS/MS测定的控制标准。质控样品分析的典型结果如表3所示。
结论
7. 此类方法也可允许选择性的、特异性的、并按高通量方式同时测定一份样品中的几种不同β淀粉样肽,而同时仍能达到低浓度内源性β淀粉样肽分析所需的高灵敏度。这是一个明显的优点,因为ELISA测定需要使用多种抗体进行多次测定。
所选择的参考文献