钠离子通道检测

 详细说明

表达各种钠离子通道亚型的稳定细胞系信息如下   

  钠通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10% 胎牛血清及1.2mg/ml G418的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5%。

  细胞传代：除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1 ml TrypLE? Express溶液，37°C孵育1分钟。当细胞从皿底脱离，加入5 ml 37°C预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rmp离心5分钟收集细胞。扩增或维持培养，将细胞接种于10厘米细胞培养皿，每个细胞培养皿，接种细胞量为3.5*10⁵ cells（zei终体积：10 ml）。

  为维持细胞的电生理活性，细胞密度必须不能超过80%。

  膜片钳检测，实验之前细胞用TrypLE™  Express分离，将3*10³ 细胞铺到盖玻片上，在24孔板中培养（zei终体积：500μl），18个小时后，进实验检测。

电生理检测方法

     用微电极拉制仪（P97，Sutter Instruments）将毛细玻璃管（BF150-86-10，Sutter Instruments）拉制成记录电极。在倒置显微镜（IX71，Olympus）下操纵微电极操纵仪（MP285，Sutter Instruments）将记录电极接触到细胞上，给予负压抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻。不给予漏电补偿。当全细胞记录的电流稳定后开始给药，每个药物浓度作用至5分钟后检测下一个浓度，在记录期间独立重复检测多个细胞。所有电生理实验均在室温下进行。实验数据由 EPC-10 放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster (HEKA)软件中。

检测实验的刺激方案：

数据质量标准

(1) 串联电阻 ≤ 20 MΩ；

(2) 封接电阻 ≥ 1 GΩ；

(3) 起始电流幅度适宜；

(4) 电流没有明显的自发性衰减(5分钟内自发性衰减小于5%)；

(5) 在膜电位为-80mV下无明显的漏电流 (漏电流 ≤ 100 pA)。

数据分析

首先将每一个药物浓度作用后的电流和空白对照电流标准化(),然后计算每一个药物浓度对应的抑制率(1-)。对每一个浓度计算平均数和标准误， 并用以下的方程计算每种化合物的半抑制浓度：

    用以上方程对剂量依赖效应进行非线性拟合， 其中c代表药物浓度，IC50为的半抑制浓度，h代表希尔系数。曲线拟合以及IC50的计算利用IGOR软件完成。

NaV1.1

NaV1.2

NaV1.3

NaV1.5

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途